Survivin基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Trail誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前主要的治療方法以手術(shù)、介入、放療為主，而基因治療有可能成為肝癌治療的新手段。在腫瘤的基因治療研究中，關(guān)鍵問(wèn)題在于提高目的基因的靶向性。利用在多數(shù)腫瘤中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子序列，驅(qū)動(dòng)目的基因特異地在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，是解決腫瘤基因治療靶向性問(wèn)題的一個(gè)有效途徑[1]。Survivin是IAP家族的新成員。Survivin組織分布的最大特點(diǎn)是具有明顯的細(xì)胞選擇性，其在胚胎及多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)[2]，但是不表達(dá)于終

2、末分化的正常組織[3]。因此，研究者認(rèn)為survivin啟動(dòng)子可用作腫瘤靶向治療的工具，啟動(dòng)下游殺傷基因特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，從而避免損傷正常細(xì)胞。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL）又稱為Apo2L（ligand），是Wiley發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員[4]，Trail的最大特點(diǎn)是能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞

3、無(wú)影響，而這一選擇性殺傷特性也預(yù)示著Trail在腫瘤治療中有廣泛的應(yīng)用前景[5]。本研究我們擬構(gòu)建含有Survivin340啟動(dòng)子及Trail全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒。評(píng)價(jià)其在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)能力的差異以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的情況。 目的： 克隆人TrailcDNA基因和Survivin基因啟動(dòng)子，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail，檢測(cè)Survivin基因啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中誘導(dǎo)Tr

4、ail蛋白表達(dá)能力的差異，并進(jìn)一步檢測(cè)重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的情況。 材料和方法： 1、主要材料：肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，小鼠胚胎正常成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（-），pluc340質(zhì)粒（含有survivin特異啟動(dòng)子的pGL3載體），大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。 2、方法： 2.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Trail及Survivin340

5、啟動(dòng)子基因序列，分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物。Trail基因上游引物：5'-TCCGCTCGAGCCTCACTGACTATAAAAGAATAGAG-3'包含了XhoⅠ酶切位點(diǎn)：下游引物：5'-CCCAAGCTTGGGTTAGCCAACTAAAAAGGCC-3'包含了HindⅢ酶切位點(diǎn)。用該對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為955bp。Survivin啟動(dòng)子基因上游引物5'-GAAGATCTTCTCAAGTGATGCTCCTGCCTA-3'包

6、含了BglⅡ的酶切位點(diǎn)，下游引物5'-TCCGCTCGAGTGTAGAGATGCGGTGGTCCT-3'包含了XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。用該對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為423bp。 2.2Trail基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 HepG2肝癌細(xì)胞（由本室常規(guī)培養(yǎng)保存）用含有100mL/L新生牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。用Trizol（TaKaRa公司產(chǎn)品）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒（fermentas公

7、司）說(shuō)明操作制備cDNA。取2μlcDNA用上游引物和下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃15s，變性94℃30s，退火53℃30s，延伸68℃75s，32個(gè)循環(huán)，終末延伸68℃5min。所得目的片段用限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后插入pcDNA3.1（-）的XhoⅠ和HindⅢ多克隆位點(diǎn)之間，所得質(zhì)粒命名為pcDNA3.1/Trail，進(jìn)行測(cè)序。 2.3含有Survivin340啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒構(gòu)建

8、 克隆Survivin340啟動(dòng)子基因，以pluc340為模板（本實(shí)驗(yàn)室保存），利用上下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性94℃15s，變性94℃30s，退火56.5℃30s，延伸68℃75s，30個(gè)循環(huán)，終末延伸68℃5min。對(duì)所得目的片段及之前構(gòu)建好的重組載體pcDNA3.1/Trail分別用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，將酶切后產(chǎn)物純化后用T4連接酶進(jìn)行連接，所得質(zhì)粒命名為pcDNA3.1/SurP/Trai

9、l，進(jìn)行測(cè)序。 2.4脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前一天，將HepG2細(xì)胞與3T3細(xì)胞兩組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)至6孔培養(yǎng)板中，濃度為2×105個(gè)/ml。當(dāng)細(xì)胞融合約80%，用Iipofectamine-LTX轉(zhuǎn)染試劑盒將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail導(dǎo)入HepG2及3T3細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染72小時(shí)提取兩組細(xì)胞的總蛋白，用WesternBlot檢測(cè)兩組細(xì)胞Trail蛋白表達(dá)的差異。 2.5重組質(zhì)粒的鑒定

10、用細(xì)胞裂解液RIPA和PMSF溶解細(xì)胞，12000xg離心30min去殘?jiān)?，BCA法蛋白定量，約50μg蛋白加入2xSDS上樣緩沖液96℃變性10min。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，印跡轉(zhuǎn)染醋酸纖維膜。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液在室溫下封閉2h以去除非特異結(jié)合部分，加入抗TRAIL抗體于4℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1h后，用WesternBlotChemiluminescence試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞Trail蛋白的表達(dá)

11、。 2.6半定量RT-PCR檢測(cè)pcDNA3.1/SurP/Trail重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TrailmRNA表達(dá) 將HepG2細(xì)胞分為3組細(xì)胞，培養(yǎng)子6孔板各一個(gè)孔中，第一組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SurP/Trail重組質(zhì)粒，定義為重組質(zhì)粒組；第二組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（-）空白載體，定義為空白質(zhì)粒組；第三組未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，定義為未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后提取各孔細(xì)胞的總RNA，行半定量RT-PCR檢測(cè)各組不同處理的細(xì)胞中Tra

12、ilmRNA的表達(dá)情況。 2.7雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞分為3組，分組同2.6項(xiàng)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/SurP/Trail重組質(zhì)粒48小時(shí)后收集各組細(xì)胞，參照AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒提供方法，處理細(xì)胞后用雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的凋亡率。 2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以mean±SD來(lái)表達(dá)，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；三組比較采用單

13、向方差分析（One-wayANOVA），組間多重比較采用Bonferroni方法分析，并且當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 本研究中通過(guò)分子克隆技術(shù)，成功克隆了TrailcDNA基因及Survivin啟動(dòng)子基因，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/SurP/Trail，通過(guò)Westernblot檢測(cè)到重組質(zhì)粒在HepG2癌細(xì)胞中特異生物活性較在3T3正常細(xì)胞中強(qiáng)，能明顯誘導(dǎo)Trail蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)