DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞中的功能學(xué)及其啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　功能未知基因DEPDC7是從基因芯片數(shù)據(jù)挖掘得到，DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)參與的生命活動(dòng)及其分子機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究通過探討DEPDC7基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的增殖、克隆形成和侵襲遷移能力的影響，并初步鑒定了DEPDC7基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域，為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制等指明方向。
　　方法：
　　(1)提取肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1和SMMC-7721以及正常肝細(xì)胞L-02的DEPDC7 R

2、NA和蛋白，通過Real-Time PCR和Western blot方法檢測(cè)DEPDC7基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)差異。
　　(2)構(gòu)建過表達(dá)重組載體 pLV-DEPDC7和沉默重組載體pLV-DEPDC7-shRNA，通過慢病毒包裝并感染細(xì)胞的方法，獲得DEPDC7過表達(dá)細(xì)胞株和沉默細(xì)胞株，并通過 Real-Time PCR和Western blot方法檢測(cè)DEPDC7的表達(dá)情況。
　　(3)利用MTT法和平板克隆法

3、檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲遷移能力。
　　(4)利用生物信息學(xué)方法對(duì)人 DEPDC7基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，通過PCR法擴(kuò)增DEPDC7基因近端啟動(dòng)子序列，構(gòu)建一系列的啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告基因載體，隨后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)并檢測(cè)各缺失片段螢光素酶活性。
　　結(jié)果：
　　(1)與正常肝細(xì)胞L-02比較，DEPDC7的mRNA和蛋白水

4、平在四株肝癌細(xì)胞中均是低表達(dá)。
　　(2)成功建立 DEPDC7基因過表達(dá)肝癌細(xì)胞系 Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7，蛋白表達(dá)顯著提高。成功建立DEPDC7基因沉默肝癌細(xì)胞系HepG2-RNAi，mRNA和蛋白水平均顯著降低。
　　(3)與對(duì)照組細(xì)胞相比，DEPDC7基因表達(dá)上調(diào)可以將 Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。相應(yīng)的，細(xì)胞增殖能力、克隆形成能

5、力和侵襲遷移能力明顯下降。
　　(4)與對(duì)照組細(xì)胞相比，DEPDC7基因表達(dá)下調(diào)可以將HepG2-RNAi的細(xì)胞周期促使從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。相應(yīng)的，細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力和侵襲遷移能力明顯增加。
　　(5)人 DEPDC7基因位于11p13。成功構(gòu)建不同長(zhǎng)度缺失片段的啟動(dòng)子重組質(zhì)粒。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，所有的重組質(zhì)粒均表現(xiàn)出熒光素酶活性，其中DEPDC7P-3活性最強(qiáng)。
　　結(jié)論：<

6、br>　　(1)本研究首次探討了DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。DEPDC7基因過表達(dá)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，干擾DEPDC7基因則可以明顯提高肝癌細(xì)胞增殖能力。推測(cè)DEPDC7基因參與細(xì)胞周期調(diào)控，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力的改變。
　　(2)DEPDC7基因過表達(dá)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移，相反干擾DEPDC7基因則可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲遷移。推測(cè) DEPDC7基