UHS-蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞的研究.pdf

1、為了加速建立利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的通過動物被毛獲取蜘蛛絲蛋白的新方法，本研究以小鼠為模型，在利用常規(guī)法建立小鼠成纖維細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，依次通過小鼠皮膚特異性啟動子的克隆、連接蜘蛛絲蛋白基因的表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞等程序，探討了建立轉(zhuǎn)蜘蛛蛋白基因二聚體陽性細(xì)胞的可能性。其結(jié)果:
　　(1)采用常規(guī)方法，利用新鮮或冷藏保存96h以內(nèi)的胎鼠皮膚經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)后建立了小鼠成纖維細(xì)胞系。
　　(2)對GenBank中的蜘蛛拖絲蛋

2、白基因序列人工合成的絲蛋白基因單體，利用不同的酶切位點(diǎn)進(jìn)行了二聚化，通過用BglⅡ、NcoⅠ及BamHⅠ、NcoⅠ分別雙酶切構(gòu)建了蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體的質(zhì)粒;
　　(3)成功克隆了在小鼠皮膚中特異表達(dá)的超高硫角蛋白(UHS)啟動子。將其與pAcGFP1-N1載體以及pβgal-Basic載體連接，分別構(gòu)建了UHS-GFP和UHS-β-gal表達(dá)載體;所構(gòu)建的UHS-GFP具有體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞的活性，而UHS-β-gal表

3、達(dá)載體具有在胎鼠皮膚塊組織中的表達(dá)活性。
　　(4)通過BglⅡ和BamHⅠ雙酶切得到小于5000bp和1000～2000bp的條帶，PCR鑒定得到約700bp的UHS條帶，以此驗(yàn)證成功構(gòu)建UHS-2S-3.1表達(dá)載體。
　　(5)對轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞進(jìn)行G418抗性篩選擴(kuò)增的陽性細(xì)胞，經(jīng)對其基因組DNA的PCR鑒定，確認(rèn)基因組整合有目的基因（蜘蛛絲蛋白基因二聚體）。
　　上述結(jié)果為進(jìn)一步開展轉(zhuǎn)蜘蛛絲蛋白基因的陽性細(xì)胞