人皮膚成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染Brg1基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：2010年，Singhal研究小組發(fā)現(xiàn)染色體重塑復(fù)合物在細(xì)胞重編程過程中起著關(guān)鍵作用，Brg1是作為其核心酶，與Baf155聯(lián)合高表達(dá)可以顯著提高小鼠體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的效率。此外大量研究顯示，Brg1(brahma-related gene1)能與多種蛋白質(zhì)相互作用，參與DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、基因重組等過程，在細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡中發(fā)揮重要作用，因此 Brg1有著非常重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。本實(shí)驗(yàn)旨

2、在探討重組Brg1基因轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞的可行性，以及轉(zhuǎn)染Brg1基因?qū)?xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步進(jìn)行人成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的相關(guān)研究做準(zhǔn)備。
　　目的：探討重組Brg1基因體外轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞的可行性，以及轉(zhuǎn)染Brg1基因后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　方法：構(gòu)建真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-Brg1-GFP后，用載體pcDNA3.1-Brg1-GFP和空載體 pcDNA3.1-GFP分別體外轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)

3、胞，將細(xì)胞分為 pcDNA3.1-Brg1-GFP載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-GFP空載體轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組；Brg1轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白發(fā)光情況，并通過流式細(xì)胞儀確定各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；以GAPDH為內(nèi)參，Realtime PCR法比較轉(zhuǎn)染48h后Brg1mRNA在三組細(xì)胞的表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染后1-5天內(nèi)，MTT法每隔24h檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡下見到Brg1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；轉(zhuǎn)

4、染48h后，Brg1轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、空白未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)陽性率分別為：（73.01±7.47）％、（69.17±11.95）%、(4.38±2.92)%，其中Brg1轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=5，p>0.05）；Realtime PCR法確定Brg1mRNA在三組細(xì)胞中的表達(dá)分別為：6.30±0.89、1.93±0.54、1.87±0.74，其中空載體轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=5，P>0.