皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建角膜基質(zhì)組織的實驗研究.pdf

1、目的：組織工程角膜為角膜移植提供了一種可行的供體來源。前期的研究表明：以角膜基質(zhì)細(xì)胞可以構(gòu)建角膜基質(zhì)組織，但角膜基質(zhì)細(xì)胞來源有限，為尋找新的種子細(xì)胞來源，文中進(jìn)行了以皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建角膜基質(zhì)組織的探索。 方法：1.以皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建豬角膜基質(zhì)組織的初步研究分離培養(yǎng)胎豬皮膚成纖維細(xì)胞，收集原代培養(yǎng)4天的胎豬皮膚成纖維細(xì)胞，接種聚羥基乙酸(PGA)圓盤支架，形成細(xì)胞-PGA復(fù)合物，體外培養(yǎng)一周后移植于成年豬角膜基質(zhì)層內(nèi)。觀察植入

2、組織在角膜內(nèi)的變化情況，并于第8周取材進(jìn)行大體和組織學(xué)檢測。同時，對側(cè)眼采用與實驗組相同的方法，設(shè)置角膜基質(zhì)細(xì)胞-聚羥基乙酸復(fù)合物對照組。2.以皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建兔角膜基質(zhì)組織分離培養(yǎng)同種異體新生兔皮膚成纖維細(xì)胞，用腺病毒轉(zhuǎn)染增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因標(biāo)記細(xì)胞，接種細(xì)胞于聚羥基乙酸(PGA)圓盤支架，形成細(xì)胞-PGA復(fù)合物，體外培養(yǎng)一周后移植于成年兔角膜基質(zhì)層。動態(tài)觀察構(gòu)建組織在角膜內(nèi)的變化情況，并于第3、6、8周取材進(jìn)行大體和

3、組織學(xué)檢測，并檢測EGFP的表達(dá)。透射電鏡觀察第8周新生組織，并測定組織膠原纖維直徑。同時，設(shè)置單純聚羥基乙酸對照組、軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸對照組和成纖維細(xì)胞-聚羥基乙酸體外培養(yǎng)3周對照組。為進(jìn)一步說明植入的皮膚成纖維細(xì)胞在角膜內(nèi)的轉(zhuǎn)化情況，以免疫組織熒光技術(shù)檢測實驗組和皮膚成纖維細(xì)胞-聚羥基乙酸體外培養(yǎng)3周組新生組織中，角膜基質(zhì)特異蛋白多糖Keratocan的表達(dá)情況。 結(jié)果：1.以皮膚成纖維構(gòu)建豬角膜基質(zhì)組織移植術(shù)后8周，角膜

4、逐漸恢復(fù)透明，聚羥基乙酸降解吸收完全，新生角膜基質(zhì)樣組織膠原與角膜表面平行，排列較整齊，與對照組無明顯差異。2.以皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建兔角膜基質(zhì)組織術(shù)后8周，實驗組角膜逐漸恢復(fù)透明，聚羥基乙酸降解吸收完全，新生角膜基質(zhì)樣組織膠原與角膜表面平行，排列較整齊。角膜基質(zhì)組織切片熒光顯微鏡檢測顯示GFP陽性細(xì)胞的存在。膠原纖維直徑檢測提示，實驗組與正常角膜無統(tǒng)計學(xué)差異。單純聚羥基乙酸對照組，隨著材料降解，角膜逐漸透明，但組織學(xué)觀察見材料移植區(qū)無新

5、生組織形成。軟骨細(xì)胞-聚羥基乙酸對照組，角膜不透明，有明顯的軟骨組織形成。皮膚成纖維細(xì)胞-聚羥基乙酸體外培養(yǎng)3周組，角膜不透明，組織學(xué)提示形成與角膜基質(zhì)完成不同的組織。Keratocan是角膜基質(zhì)細(xì)胞特異分泌的硫酸角質(zhì)素蛋白多糖，皮膚組織沒有表達(dá)。實驗組新生組織Keratocan表達(dá)陽性，而皮膚成纖維細(xì)胞-聚羥基乙酸體外培養(yǎng)3周組新生組織Keratocan表達(dá)陰性。 結(jié)論：1.以皮膚成纖維細(xì)胞可以替代角膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建角膜基質(zhì)組織