人皮膚成纖維細胞攪拌培養(yǎng)和保存的初步研究.pdf

1、目的：利用磁力攪拌培養(yǎng)器微載體攪拌培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，觀察細胞的生長增殖情況；檢測細胞增殖達到平臺期后不同保存條件下細胞的活力及保存時間；觀察攪拌培養(yǎng)微載體上細胞接種到普通培養(yǎng)瓶中移行、增殖和分泌Ⅰ型膠原含量的情況；觀察攪拌培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞用于制備復方殼多糖人工皮膚后的增殖情況及細胞形態(tài)。
　　 方法：利用酶消化法分別培養(yǎng)出人包皮成纖維細胞和包皮表皮細胞，選取6～10代的人皮膚成纖維細胞(細胞量為8×106，密度為4×1

2、04/ml)接種到濃度為2.5g/L的微載體cytodex-3攪拌培養(yǎng)瓶中，用200ml改良培養(yǎng)基按20rpm/min，連續(xù)攪拌50min，暫停5min，循環(huán)模式進行攪拌培養(yǎng)，以靜態(tài)培養(yǎng)為對照，利用CASY細胞計數(shù)儀檢測兩種方法培養(yǎng)每隔24h后細胞各自的增殖情況，倒置相差顯微鏡定時觀察和掃描電鏡選時相點觀察細胞形態(tài)并照相；檢測細胞培養(yǎng)增殖達到平臺期后的保存時間和MTT法檢測在室溫和4℃保存條件下細胞混懸液的OD值，據(jù)此計算出活細胞量制作

3、活細胞量曲線；在攪拌培養(yǎng)第9天取微載體成纖維細胞混懸液15ml進行移行培養(yǎng)觀察，并做細胞爬片的vimentin免疫組化染色鑒定人皮膚成纖維細胞；用ELISA方法測定移入方瓶培養(yǎng)后培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原的含量；按我科方法制備復方殼多糖組織工程皮膚，對比觀察攪拌培養(yǎng)和普通培養(yǎng)的成纖維細胞植入復方殼多糖組織工程皮膚后的增殖情況，進行HE染色觀察。
　　 結果：人皮膚成纖維細胞接種在微載體上攪拌培養(yǎng)具有正常的形態(tài)，與靜態(tài)培養(yǎng)比較，需要的微載體

4、量少(2.5g/L)，以此微載體濃度進行細胞擴增培養(yǎng)，細胞總產(chǎn)量與接種量之間呈數(shù)量級擴增，大多數(shù)微載體上能長滿成纖維細胞，且需要的培養(yǎng)基量少(每瓶200ml改良培養(yǎng)基)，能快速大規(guī)模擴增，從接種增殖到達平臺期只需10～12天，且收獲細胞量是接種量的5倍左右；在攪拌培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞達到增殖平臺期后，室溫和4℃條件下在微載體上保存的細胞活力比靜態(tài)培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞保存的時間長，室溫條件下能保存三周左右，在第3天時保存的細胞活力有較

5、大一過性降低，隨后又逐漸恢復，活力在第19天時最佳，可達到86.96％，到第23天時細胞活力明顯下降只有64.36％，而4℃條件下相應保存的細胞活力到第19天時只有13.04％，細胞活力下降明顯，均低于室溫保存的細胞；攪拌培養(yǎng)后第9天移入方瓶中培養(yǎng)的細胞具有正常形態(tài)和增殖特性，收集不同時間點的細胞培養(yǎng)液測定Ⅰ型膠原含量結果顯示，在一定時間范圍內(nèi)，Ⅰ型膠原含量前5天隨時間的推移和細胞的增殖而分泌增加；觀察混合成纖維細胞培養(yǎng)的復方殼多糖組織