四種病毒載體對人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的研究.pdf

1、基因治療是指將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導(dǎo)入目的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，使其獲得特定的功能，從而達(dá)到治療的目的?；蛑委熡扇齻€方面組成：受體細(xì)胞、載體以及目的基因。 皮膚成纖維細(xì)胞(dermalfibroblasts,DFs)獲取方便，可以在體外大量擴(kuò)增，容易進(jìn)行遺傳改造，并且具有容易移植和不易轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)，因此DFs成為目前基因治療應(yīng)用較為廣泛的靶細(xì)胞，本論文亦將此細(xì)胞作為研究對象。 目前，基因治療面臨的瓶頸問題在于轉(zhuǎn)染效率低下，而決

2、定基因治療轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵點(diǎn)之一就在于載體的選擇。目前基因治療所應(yīng)用的載體主要包括病毒載體和非病毒載體，其中應(yīng)用最多的是病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，皰疹病毒和慢病毒，其中前四種已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。在人類基因治療常用的病毒載體中，腺相關(guān)病毒(Adeno-associatedviruses，AAV)的安全優(yōu)勢以及長效表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)使其成為了基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的寵兒。而腺病毒(Adenovirus，Ad)載體則因具有感染效率

3、和外源基因表達(dá)水平高、高滴度制備較簡單等特點(diǎn)而被廣泛用于基因治療研究和臨床試驗(yàn)中。因此，本論文選擇AAV和Ad為研究對象。由于病毒載體的衣殼蛋白是決定其對靶細(xì)胞嗜性的主要因素，進(jìn)行衣殼蛋白改造后的載體有望改變載體親嗜性而提高轉(zhuǎn)染效率。我們在選用常規(guī)使用的AAV2和Ad5的基礎(chǔ)上，還選用了將AAV2的ITRs包被進(jìn)入AAV1的衣殼蛋白形成的嵌合型載體-AAV2/1，以及將Ad35載體的纖突整合到Ad5載體上形成的Ad5/F35作為研究對象

4、，通過比較他們的轉(zhuǎn)染效率來篩選適合DFs的載體。 本學(xué)位論文以eGFP為報(bào)告基因，以流式細(xì)胞檢測(flowcytometry，F(xiàn)CM)和熒光顯微照相為研究手段，比較AAV2-eGFP、AAV2/1-eGFP、Ad5-eGFP和Ad5/F35-eGFP對DFs的轉(zhuǎn)染效率，探討了四種病毒載體轉(zhuǎn)染DFs的適合條件，同時(shí)利用MTT法研究四種病毒載體轉(zhuǎn)染后DFs的增殖性能，希望篩選出對DFs嗜性較高的載體，同時(shí)也進(jìn)一步為成纖維細(xì)胞用于基因

5、治療的規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 AAV2-eGFP和AAV2/1-eGFP分別按照轉(zhuǎn)染倍數(shù)MOI為104、105、106轉(zhuǎn)染DFs，Ad5-eGFP和Ad5/F35-eGFP按照感染復(fù)數(shù)MOI為10、25、50、100轉(zhuǎn)染DFs，轉(zhuǎn)染后24h用流式細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的熒光強(qiáng)度，MTT檢測兩者對DFs增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： AAV2/1-eGFP對DFs無感染能力，MOI105時(shí)AAV2轉(zhuǎn)

6、染DFs24h后轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到(22.16+5.59)％，表明AAV2轉(zhuǎn)染DFs可以有效獲得皮膚基因修飾細(xì)胞，進(jìn)一步用于基因治療和基因修飾。 Ad5-eGFP和Ad5/F35-eGFP在MOI為10、25、50、100時(shí)轉(zhuǎn)染效率隨著：MOI升高而呈上升趨勢，MOI100時(shí)，Ad5/F35-eGFP轉(zhuǎn)染DFs24h后轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90％左右，Ad5-eGFP達(dá)到70％左右。 綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，結(jié)論如下： Ad5/F