轉(zhuǎn)染HSG基因干預(yù)COPD氣道成纖維細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的：
　　 免疫組化法檢測(cè)大鼠細(xì)胞增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene，rHSG)蛋白在正常及慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)大鼠氣道成纖維細(xì)胞細(xì)胞中的不同表達(dá)；通過體外轉(zhuǎn)染(Homohyperplasia suppressor gene，hHSG)基因至COPD氣道成纖維細(xì)胞中，觀察pEGFP-hHSG對(duì)成纖維細(xì)胞增

2、殖的影響，為進(jìn)一步基因治療打下理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 通過制造COPD大鼠模型，組織塊法培養(yǎng)氣道成纖維細(xì)胞，用免疫組化檢測(cè)rHSG基因在正常大鼠和COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞中的表達(dá)；感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pEGFP-n1、pEGFP-hHSG，堿裂解法抽提質(zhì)粒，經(jīng)電泳及DNA測(cè)序鑒定，然后通過脂質(zhì)體法將pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COPD患者氣道成纖維細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，轉(zhuǎn)染后用免疫組化檢測(cè)空白對(duì)照組(CO

3、PD未轉(zhuǎn)染組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-nl組、轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組中hHSG蛋白的表達(dá)，MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。應(yīng)用SPSS11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間q檢驗(yàn)，P<0.05為差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 COPD造模成功后，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)，免疫組化學(xué)結(jié)果顯示rHSG蛋白在COPD大鼠組和正常大鼠組中皆有表達(dá)，其灰度值分別113.7

4、96±13.173、184.327±3.238，rHSG基因在COPD大鼠氣道成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯低于正常大鼠氣道成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。原代培養(yǎng)正常人和COPD患者氣道成纖維細(xì)胞，抗波形蛋白鑒定實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，時(shí)差法純化得到純氣道成纖維細(xì)胞；氯化鈣法制備得到高轉(zhuǎn)化率的感受態(tài)細(xì)胞(DH5a)，pEGFP-n1、pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增，EcoI和SnaBI酶雙酶切電泳鑒定得到

5、片段長(zhǎng)度約為2274bp的基因片段，測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒中含有hHSG基因編碼區(qū)，其片段長(zhǎng)為2274bp。經(jīng)GeneBank Blast分析證實(shí)DNA插入序列與目的片段DNA序列完全完全一致。將pEGFP-n1、pEGFP-hHSG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COPD氣道成纖維細(xì)胞中，在銀光顯微鏡可見轉(zhuǎn)染組(pEGFP-n1、pEGFP-hHSG)細(xì)胞中皆有綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達(dá)，其主要位于細(xì)胞核周圍。通過免疫組化方法檢測(cè)得hHSG在空白組對(duì)照、p

6、EGFP-n1、在pEGFP-hHSG三組細(xì)胞的細(xì)胞核及核周均呈現(xiàn)不同程度的陽性反應(yīng)，其中空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）和轉(zhuǎn)染pEGFP-n1組陽性反應(yīng)較弱，而轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組細(xì)胞陽性反應(yīng)較強(qiáng)，空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pEGFP-nl組與轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組所測(cè)灰度值比值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明hHSG在這些細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)。細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果示轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組細(xì)胞增殖受到明顯抑制，而

7、空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染pEGFP-nl組細(xì)胞增殖無明顯改變。轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組在第1、2、3、4、5天對(duì)COPD氣道成纖維細(xì)胞增殖的抑制率分別為24.6％，28.7％，43.6％，52.3％和62％，且抑制率與時(shí)間呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)染pEGFP-hHSG組與空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pEGFP-nl組之間有明顯差異(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-nl組與空白對(duì)照組之間無明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 rHSG基因在