人牙髓成纖維細(xì)胞發(fā)生nemosis的初步研究.pdf

1、成纖維細(xì)胞是廣泛分布于體內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞,人牙髓成纖維細(xì)胞(Human Dental Pulp Fibroblasts,HDPF)作為牙髓中的主體細(xì)胞,傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為其主要負(fù)責(zé)合成細(xì)胞外基質(zhì),近來研究發(fā)現(xiàn) HDPF在牙髓免疫和炎癥中發(fā)揮重要的作用,可能成為未來牙髓炎癥抗炎治療的潛在靶點。
　　Nemosis是新近報道發(fā)生在成纖維細(xì)胞的一種細(xì)胞激活和死亡形式。J Bizik等學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)正常的成纖維細(xì)胞如果誘使其形成“球狀”集落,其非但

2、不生長,反而經(jīng)歷一種被稱為“nemosis”的細(xì)胞激活途徑[1]。發(fā)生nemosis的成纖維細(xì)胞首先形成“球狀”聚集,隨后產(chǎn)生促炎性,蛋白水解和生長因子應(yīng)答,于此同時開始自發(fā)性分解,此過程具有程序性細(xì)胞壞死的特征[2-4]。已報道 nemosis能發(fā)生于包括新生兒包皮成纖維細(xì)胞,新生兒和成人皮膚成纖維細(xì)胞等,但牙髓組織的主體細(xì)胞 HDPF能否發(fā)生nemosis,至今少有研究[2,4]。
　　Nemosis可用來研究成纖維細(xì)胞的激活

3、以及成纖維細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間關(guān)系,是一種重要的實驗?zāi)Ｐ蚚2]。迄今,nemosis作用的靶細(xì)胞包括癌細(xì)胞,上皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞,nemosis作用的靶細(xì)胞是否包括干細(xì)胞以及之間的相互作用,國內(nèi)外未見有報道。為此本實驗通過三維培養(yǎng)HDPF構(gòu)建nemosis模型,探討HDPF發(fā)生nemosis的特診,并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用nemosis模型,研究HDPF發(fā)生 nemosis對人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem ce

4、lls,hDPSCs)細(xì)胞遷移的影響,為干細(xì)胞修復(fù)炎癥損傷牙髓提供實驗基礎(chǔ)。
　　1、三維培養(yǎng)HDPF形成球狀聚集的研究
　　成纖維細(xì)胞激活nemosis途徑起始于在U形96孔板板底預(yù)先用瓊脂鋪板后三維培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,這種三維培養(yǎng)體系鮮明的形態(tài)學(xué)特征就是形成肉眼可見的球狀細(xì)胞聚集體。
　　在第一部分實驗,我們通過反復(fù)摸索實驗條件,三維培養(yǎng)HDPF構(gòu)建HDPF形成球狀細(xì)胞聚集體,在此基礎(chǔ)上分別用 CCK8實驗和 LDH實

5、驗進(jìn)行了三維培養(yǎng)的HDPF和普通HDPF細(xì)胞代謝和胞膜損傷的研究,結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時間的延長,三維培養(yǎng)的HDPF細(xì)胞活力受到影響,活細(xì)胞數(shù)逐漸減少,細(xì)胞胞膜損傷程度逐漸加重,掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察了三維培養(yǎng)聚集成團(tuán)的HDPF隨著培養(yǎng)時間的延長,逐漸發(fā)生細(xì)胞膜穿孔破損,球體內(nèi)細(xì)胞線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,細(xì)胞內(nèi)空泡形成,染色質(zhì)邊集,核固縮,核溶解和核碎裂等符合細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征,此部分結(jié)果提示三維培養(yǎng)的HDPF可形成球

6、狀聚集,隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸發(fā)生細(xì)胞壞死。
　　2、三維培養(yǎng)HDPF發(fā)生nemosis釋放炎性因子和趨化因子的研究
　　發(fā)生nemosis的成纖維細(xì)胞球能分泌大量炎性因子和趨化因子,其中一個特征是誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達(dá)和釋放白介素-8(Interleukin-8, IL-8)。COX-2是誘導(dǎo)花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎谽2(prostaglandin E2,PGE2)的酶,既往研

7、究指出炎癥牙髓較正常牙髓組織 COX-2表達(dá)增高,因此我們選擇研究COX-2,PGE2和IL-8作為研究HDPF發(fā)生nemosis釋放炎癥因子和趨化因子的指標(biāo)。
　　第二部分的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)的HDPF隨著培養(yǎng)時間的延長,炎癥因子COX-2蛋白表達(dá)逐漸增高,釋放PGE2逐漸增多,同時趨化因子IL-8的釋放逐漸增多,球體聚集后此過程不可逆轉(zhuǎn),而普通貼壁培養(yǎng)的HDPF在培養(yǎng)期間上述因子未見明顯表達(dá)。值得注意的是在我們的三維培養(yǎng)體系

8、中,不存在外界毒力因子, COX-2,PGE2和 IL-8的高表達(dá)僅僅是由于 HDPF細(xì)胞和細(xì)胞之間球狀聚集發(fā)生nemosis引起的,提示HDPF發(fā)生nemosis釋放炎癥因子和趨化因子是程序性的。
　　3、三維培養(yǎng)HDPF發(fā)生nemosis對人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)遷移的影響
　　長期以來牙髓炎癥被認(rèn)為不利于牙髓損傷修復(fù),然而最近的研究提示炎癥反應(yīng)可能與牙髓損傷修復(fù)中干細(xì)胞的激活有關(guān)。I. About等學(xué)者指出牙本質(zhì)-

9、牙髓復(fù)合體損傷修復(fù)的研究不僅需要研究干細(xì)胞潛力,也需要研究牙髓中支持細(xì)和干細(xì)胞之間的相互作用。本研究第二部分研究結(jié)果表明HDPF發(fā)生nemosis可釋放一系列炎癥因子和趨化因子,提示我們可以利用nemosis模型研究HDPF和hDPSCs之間的相互作用。
　　因此,本研究的第三部分運(yùn)用transwell細(xì)胞遷移實驗探討三維培養(yǎng)HDPF發(fā)生nemosis對hDPSCs細(xì)胞遷移的影響,發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)HDPF條件培養(yǎng)液較普通貼壁培養(yǎng) HD