賁門腺上皮不同癌變階段間質成纖維細胞的初步研究.pdf

1、目的:腫瘤間質微環(huán)境中最重要的成份——活化的成纖維細胞，被稱作癌相關成纖維細胞（carcinoma-associatedfibroblasts，CAFs），能夠分泌多種生長因子、趨化因子，可通過多種信號通路來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過觀察賁門正常(normal)、癌前病變(precancerosis)、癌(carcinoma)組織中間質成纖維細胞α-SMA和CD34的表達并將其進行體外培養(yǎng)鑒定，旨在探索間質成纖維細胞在賁門不同癌變階

2、段的特征及變化，為以后進一步研究賁門腺癌相關成纖維細胞(CAFs)在賁門上皮癌變過程中的調(diào)控作用提供良好的平臺。
　　 方法:
　　 1、免疫組織化學（immuunohistochemistry,IHC）檢測賁門正常組、低級別上皮內(nèi)瘤變組、高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組和進展期癌組共100例組織中間質成纖維細胞α-SMA和CD34的表達情況，SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析。
　　 2、分別采用組織塊貼壁法和膠原

3、酶消化法培養(yǎng)賁門正常成纖維細胞（normalfibroblasts，NFs）、賁門癌前病變的成纖維細胞(precancerousfibroblasts，PCFs)、賁門癌相關成纖維細胞(carcinoma-associatedfibroblasts，CAFs)，待細胞基本爬滿整個培養(yǎng)瓶底后進行首次傳代，運用胰蛋白酶消化法和反復貼壁法對細胞進行純化。
　　 3、倒置相差顯微鏡觀察細胞大體形態(tài)。
　　 4、MTT法檢測細胞生

4、長曲線。
　　 5、制作細胞爬片，采用瑞氏-吉姆薩染色方法，觀察細胞著色情況。采用細胞免疫組織化學技術，檢測細胞多種蛋白的表達情況，包括角蛋白(keratin)、波形蛋白(Vimentin)、結蛋白(Desmin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、CD34。
　　 6、透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)部結構。
　　 結果:
　　 1、α-SMA在賁門正常組、低級別上皮內(nèi)瘤變組、高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進展

5、期癌組的表達率分別為(0/20)、10％(2/20)、45％(9/20)、75％(15/20)、90％(18/20)。陽性細胞呈梭形，主要存在于病變周圍間質中呈絲帶樣，在進展期癌組織中密集呈條索狀包裹著癌巢。結果顯示:隨病變進展，間質成纖維細胞α-SMA陽性率表達呈上升趨勢，但與患者性別、年齡無關。
　　 2、CD34在賁門正常組、低級別上皮內(nèi)瘤變組、高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進展期癌組的間質纖維細胞中陽性表達率分別為95.

6、0％(19/20)、85％(17/20)、55％(11/20)、30％(6/20)、(0/20);在進展期癌組中CD34僅在血管內(nèi)皮細胞陽性表達，在癌周圍間質纖維細胞中不表達。結果顯示:隨病變進展，間質成纖維細胞CD34陽性率表達呈下降趨勢，但與患者年齡、性別無關。
　　 3、三種細胞的生長曲線不同，均為“S”形生長曲線，3-5d為對數(shù)生長期，細胞生長旺盛，CAFs作為已經(jīng)被活化的成纖維細胞，比其余2組細胞增殖能力明顯增強。PC

7、Fs增殖能力介于NFs和CAFs之間。
　　 4、形態(tài)學結果:①賁門正常成纖維細胞:呈扁平長梭形，大小基本一致，排列有一定的方向，單層細胞生長，存在密度抑制和接觸抑制。胞質染色均勻，單核，橢圓形，位于胞質中央。胞漿內(nèi)細胞器較發(fā)達，富含粗面內(nèi)質網(wǎng)、核糖體、高爾基體，可以見到散在微絲。②賁門癌前病變相關成纖維細胞:形態(tài)不定，排列不如正常成纖維細胞整齊，局部出現(xiàn)重疊生長的現(xiàn)象。胞質染色基本均勻，胞核增大，單核，有些胞核形狀不規(guī)則。胞漿

8、中細胞器發(fā)達，可以見到大片微絲，散在可見附著斑。③賁門癌相關成纖維細胞:形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，無方向性，重疊生長，密度抑制和接觸抑制消失。胞質染色淡，胞核大，形態(tài)不規(guī)則，核仁明顯，含1-3個核仁。胞質伸展，形成較多突起，胞漿內(nèi)細胞器發(fā)達，粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張，可以看到明顯大量的微絲，局部形成微絲束，成團形成附著斑，而且大量的微絲和致密斑遠離細胞核而分布存在。
　　 5、細胞免疫組化染色結果:三種細胞的角蛋白和結蛋白表達均為陰性，波形蛋

9、白表達均為陽性，α-SMA表達情況是賁門正常成纖維細胞為陰性，賁門癌相關成纖維細胞為陽性，賁門癌前病變相關成纖維細胞為弱陽性，CD34表達情況是賁門正常成纖維細胞為陽性，賁門癌相關成纖維細胞的CD34表達為陰性，賁門癌前病變相關成纖維細胞為弱陽性。
　　 結論:
　　 1、免疫組化與細胞培養(yǎng)均證實:賁門癌變過程中間質成纖維細胞的表型發(fā)生了變化，表現(xiàn)為CD34表達缺失和α-SMA表達獲得，提示其可能參與了賁門癌的發(fā)生與發(fā)展