胰腺癌細胞對基質(zhì)成纖維細胞的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　近年來研究顯示腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與由多種基質(zhì)細胞、細胞因子、趨化因子等組成的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，其中癌相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）越來越受到關(guān)注。胰腺癌中基質(zhì)細胞含量豐富，尤其是CAFs，大量研究認為胰腺癌中的CAFs可促進癌細胞的增殖遷移等生物學功能，但對于癌細胞在CAFs的產(chǎn)生過程中所發(fā)揮的作用及其機制的研究相對較少。
　　目的：
　　1.觀察胰腺

2、癌細胞系與正常成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs）共培養(yǎng)、癌細胞中的微囊泡（microvesicles，MVs）刺激NFs兩種方式能否誘導NFs活化成CAFs，以及上述刺激對成纖維細胞生物學行為的影響。
　　2.初步探索胰腺癌細胞促進NFs活化成CAFs的發(fā)生機制。
　　方法：
　　1.原代分離培養(yǎng)野生型 C57小鼠胰腺組織中的 NFs，將其與胰腺癌細胞系BXPC-3、SW1990進行共培養(yǎng)，運用

3、western方法檢測共培養(yǎng)后成纖維細胞中α-SMA、FAP含量，并采用edu方法檢測成纖維細胞增殖能力變化。
　　2.采用超速離心法提取上述胰腺癌細胞系中的 MVs并分別用其刺激 NFs，同樣方法檢測相應(yīng)蛋白含量以及成纖維細胞增殖能力。
　　3.采用Trizol試劑盒法提取成纖維細胞中的RNA，后進行逆轉(zhuǎn)錄以及qRT-PCR實驗檢測12種miRNA含量，并采用同樣方法提取MVs以及相應(yīng)量MV-free中上述miRNA含量；

4、
　　4．根據(jù)前述結(jié)果，在NFs中轉(zhuǎn)染miR-155類似物（即pre-miR-155），同樣檢測α-SMA、FAP含量以及成纖維細胞增殖能力。
　　5.在胰腺癌細胞株中轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑（即anti-miR-155），收集MVs并刺激NFs，然后檢測α-SMA、FAP含量以及成纖維細胞增殖能力。
　　6.選取miR-155的下游靶基因TP53inp1，western方法檢測共培養(yǎng)前后、MVs刺激前后、在NFs中轉(zhuǎn)

5、染pre-miR-155前后、敲除miR-155的MVs刺激前后的成纖維細胞中TP53inp1蛋白含量變化。
　　7.在NFs中轉(zhuǎn)染TP53inp1基因的干擾RNA，同樣采用western方法檢測干擾前后的成纖維細胞中α-SMA、FAP含量變化以及其增殖能力變化。
　　結(jié)果：
　　1. NFs分別與胰腺癌細胞系BXPC-3、SW1990共培養(yǎng)后，其中CAFs標志蛋白α-SMA含量分別提高了（84.70±0.36）％、（

6、69.11±0.26）%（P<0.05），F(xiàn)AP蛋白含量分別升高了（59.82±0.49）%，（42.17±0.11）%（P<0.05），共培養(yǎng)后CAFs增殖能力分別提高了（57.33±0.08）%，（48±0.12）%（P<0.05）。
　　2.從 BXPC-3、SW1990細胞中提取的 MVs刺激 NFs，可見刺激之后的成纖維細胞中α-SMA含量分別提高了（61.06±0.12）%，（54.47±0.20）%（P<0.05），

7、FAP蛋白含量分別升高（85.46±0.67）%，（49±0.24）%（P<0.05），刺激之后的CAFs增殖能力分別提高了（3.47±0.44）倍，（4.65±0.60）倍（P<0.05）。
　　3.在所選取的12種miRNA中，miR-155在NFs與BXPC-3、SW1990共培養(yǎng)之后的成纖維細胞中分別升高了（1.50±0.45）倍、（1.95±0.65）倍（P<0.05），同時miR-155在BXPC-3細胞的MVs以及S

8、W1990細胞的MVs刺激后的成纖維細胞中分別升高了（1.11±0.35）倍，（87.90±0.27）%（P<0.05），并且miR-155在BXPC-3細胞的MVs以及SW1990細胞的MVs中富集量分別是相應(yīng)MV-free的（7.37±0.66）倍，（7.85±0.62）倍（P<0.05）。
　　4.在NFs中轉(zhuǎn)染pre-miR-155后，成纖維細胞中α-SMA、FAP蛋白含量分別升高了（1.52±0.11）倍，（1.71±0

9、.67）倍（P<0.05），轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞增殖能力提高了（94.11±0.17）%（P<0.05）。
　　5.敲除了miR-155的胰腺癌細胞系的MVs刺激NFs后，與陰性對照相比，成纖維細胞中α-SMA、FAP蛋白含量無明顯差別；同樣地，成纖維細胞增殖能力在刺激前后無明顯變化。
　　6. NFs與BXPC-3，SW1990細胞共培養(yǎng)后，其中TP53inp1蛋白含量分別降低了（49.15±0.09）%，（27.54±0.

10、10）%（P<0.05）；同時，BXPC-3，SW1990細胞的 MVs刺激 NFs后，其中TP53inp1蛋白含量分別降低了（78.80±0.12）%，（67.95±0.14）%（P<0.05）；在NFs中轉(zhuǎn)染pre-miR-155后TP53inp1蛋白含量降低了（35.82±0.02）%（P<0.05）；但是在敲除了miR-155的胰腺癌細胞MVs刺激NFs后，該蛋白含量較陰性對照無明顯變化。
　　7. NFs中轉(zhuǎn)染TP53i

11、np1基因的干擾RNA之后，其中α-SMA、FAP蛋白含量分別升高了（90.28±0.11）%，（94.64±0.29）%（P<0.05），且轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞增殖能力提高了（92.27±0.30）%（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.胰腺癌細胞可以促進癌周圍基質(zhì)中NFs活化成 CAFs，且活化后的 CAFs增殖能力明顯增強。
　　2.在胰腺癌周圍基質(zhì)的NFs活化過程中，癌細胞中的miR-155可能通過其自身分泌的