人牙周成纖維細胞誘導形成結(jié)合上皮樣細胞的研究.pdf

1、目的:
　　 口腔結(jié)合上皮(junctional epithelium,JE)是附著在牙頸部連接結(jié)締組織與牙面的特殊上皮結(jié)構(gòu),形成齦-牙結(jié)合部。結(jié)合上皮來自于縮余釉上皮,是一種無角化無釘突的上皮組織,也是口腔生理上的一個薄弱環(huán)節(jié)。在牙周炎發(fā)生時,結(jié)合上皮首先被破壞,是牙周炎的始發(fā)部位。由于結(jié)合上皮的摧毀,導致牙周袋形成和牙槽骨吸收,牙周炎進入進展期和活動期,成為嚴重破壞口腔咀嚼功能的疾病。當牙周炎靜止后,結(jié)合上皮所構(gòu)成的齦-牙結(jié)

2、合修復緩慢,正常牙周結(jié)構(gòu)重建困難。因此,研究結(jié)合上皮的再生和誘導是研究牙周炎治療后牙周功能結(jié)構(gòu)重建的難點和重點。本研究擬通過對人牙周成纖維細胞的體外培養(yǎng),誘導形成結(jié)合上皮樣細胞,生長在脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)支架和小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架組織上,探討誘導形成的結(jié)合上皮樣細胞及其形成的組織結(jié)構(gòu),為齦-牙結(jié)合部的形成提供上皮細胞來源的理論

3、依據(jù)和實驗室數(shù)據(jù)。
　　 牙周膜又稱牙周韌帶(Periodontal ligament),是牙根與牙槽骨之間的一層結(jié)締組織,是重要的牙周支持組織,主要由成纖維細胞組成。許多研究已證明牙周成纖維細胞具有干細胞的特性[1～4]。正常情況下,牙周組織具有極強的修復能力,其修復活動是通過牙周膜中的不同細胞亞群的定向遷移和分化實現(xiàn)的[5、6]。本實驗擬采用牙周成纖維細胞,誘導成為上皮樣細胞,揭示牙周成纖維細胞具備多向分化的干細胞特征。

4、r>　　 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,選擇適合的支架材料是組織工程研究的又一重要內(nèi)容。目前,常用的支架材料有豬小腸粘膜下層支架、引導組織再生膠原膜、脫細胞真皮基質(zhì),納米羥基磷灰石等。這些材料多具有良好的生物相容性、多孔性結(jié)構(gòu)和高孔隙率及生物可降解性[7]。本實驗選用脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)和小腸黏膜下層(smallintestinal submucosa,SIS)兩種支架材料作為結(jié)合上皮樣細

5、胞附著的支架組織,探討結(jié)合上皮樣細胞對支架組織的附著能力及相容性,并探討結(jié)合上皮樣細胞在支架組織上生長的免疫特性和超微結(jié)構(gòu)。
　　 方法:
　　 1人牙周成纖維細胞的培養(yǎng)和鑒定收集河北醫(yī)大口腔醫(yī)院正畸拔除的健康完整雙尖牙(患者12～30歲),刮下其根中1/3牙周膜組織。采用組織塊培養(yǎng)法,培養(yǎng)液選用含20％胎牛血清的低糖DMEM,0.25％胰酶消化,傳代至第3代,采用抗波形蛋白vimentin和抗細胞角蛋白CK的免疫細胞化

6、學進行細胞鑒定。
　　 2人牙周成纖維細胞的誘導培養(yǎng)采用K-SFM培養(yǎng)液,對第3代人牙周成細胞進行誘導培養(yǎng)7～10天,采用抗波形蛋白vimentin和抗細胞角蛋白CK的免疫細胞化學進行細胞鑒定。
　　 3小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架組織的制備
　　 留取豬空腸組織50 cm,去除其漿膜層和肌層,在含有雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS溶液中浸泡3 h;0.25％胰酶

7、中浸泡24 h;雙蒸水漂洗,0.5％SDS24 h;雙蒸水漂洗。在含0.1％過氧乙酸的20％乙醇溶液中浸泡10 h,雙蒸水漂洗;凍干后環(huán)氧乙烷消毒備用。
　　 4人牙周成纖維細胞接種及誘導培養(yǎng)將人牙周成纖維細胞分別接種到小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)和脫細胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)上,K-SFM誘導培養(yǎng)3～5天。石蠟包埋,組織切片角蛋白CK免

8、疫組織化學染色。掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長狀態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　 1原代培養(yǎng)及其鑒定牙周組織原代培養(yǎng)7～10天,細胞爬出,獲得的成纖維細胞呈梭形、胞體大,核大,圓形或橢圓形,有1～3個核仁。采用第3代細胞進行免疫細胞化學染色鑒定,成纖維細胞對抗波形蛋白vimentin呈陽性反應,抗角蛋白CK陰性反應。
　　 2人牙周成纖維細胞誘導及鑒定經(jīng)K-SFM誘導后細胞爬片,免疫細胞化學染色,抗角蛋白CK陽性表達,表

9、明牙周成纖維細胞誘導培養(yǎng)后,具備上皮細胞的免疫特性。
　　 3小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架組織的電鏡觀察制備所得SIS經(jīng)掃描電鏡觀察為無細胞的膠原束。
　　 4人牙周成纖維細胞接種及誘導培養(yǎng)牙周成纖維細胞在支架組織上誘導培養(yǎng)后,石蠟包埋切片,免疫組織化學染色,抗角蛋白CK陽性表達。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),細胞在支架上生長良好,成片生長,細胞多邊形,扁平樣,核圓形或橢圓,核仁1