重組人骨形成蛋白-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞形成的影響及作用機(jī)理.pdf

1、正畸牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙周組織主導(dǎo)的骨吸收和骨形成活動。牙周膜細(xì)胞是正畸力的直接效應(yīng)細(xì)胞，是一組有異質(zhì)性的細(xì)胞群，其中的一些細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，同時牙周膜成纖維細(xì)胞還可以通過表達(dá)骨保護(hù)因子（osteoprotegerin，OPG）和破骨細(xì)胞分化因子（receptor activator nuclear factor kappa B ligand，RANKL）來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活動。成骨/基質(zhì)細(xì)胞與前體破骨細(xì)胞（ost

2、eoclast precursors，OCP）的直接接觸是破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）形成、分化過程中必不可少的因素之一，而且骨吸收刺激因子作用于成骨/基質(zhì)細(xì)胞后，其產(chǎn)生RANKL與前體破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞膜上表達(dá)的RANKL受體（receptor activator of nuclear factor-κB receptor，RANK）結(jié)合，引起級聯(lián)反應(yīng)，使破骨細(xì)胞分化、成熟、激活，并促進(jìn)其從骨膜釋放、轉(zhuǎn)移、粘附到骨質(zhì)表面。除

3、了RANKL，成骨/基質(zhì)細(xì)胞還生成與之對應(yīng)的OPG，可競爭性地與RANK結(jié)合，以封閉RANKL與RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，抑制骨吸收功能。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，是誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein

4、s，BMPs）之一，可促進(jìn)牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生。國外學(xué)者研究認(rèn)為，BMP-2具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和活化骨吸收功能的作用，并且通過RANKL/OPG途徑誘導(dǎo)成骨/基質(zhì)細(xì)胞參與破骨細(xì)胞的活化，但是國內(nèi)關(guān)于BMP-2對人牙周膜成纖維細(xì)胞參與的破骨細(xì)胞活化的影響尚未見報道。 牙周膜細(xì)胞是正畸施力后的主要效應(yīng)細(xì)胞，在壓力和張力的作用下，牙槽骨同時開始骨吸收和骨形成的骨改建過程，BMP-2同時具有成骨和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用

5、，明確其對牙周膜細(xì)胞的作用對于了解正畸牙齒的移動速度、矯治的效率、牙槽骨的改建以及矯治結(jié)束后的穩(wěn)定性均有重要意義。 本實(shí)驗在體外將分離培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）和從人全血中分離出的單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）進(jìn)行直接共培養(yǎng)，探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant

6、 human BMP-2，rhBMP-2）和人牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞形成中的作用；探索體外分離培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)，并探討rhBMP-2對其表達(dá)的影響。本研究將實(shí)驗分為以下兩部分： 一、rhBMP-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對體外誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞生成的影響。 目的: （1）建立人牙周膜成纖維細(xì)胞和人外周血中單個核細(xì)胞的直接共培養(yǎng)模型，觀察人牙周膜成纖維細(xì)胞在破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)形成過程中的

7、作用； （2）觀察rhBMP-2對TRAP（tartrate-resistant acidic phosphatase）陽性單個核細(xì)胞和TRAP陽性多核破骨樣細(xì)胞形成的影響； （3）探討rhBMP-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對破骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)形成的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法: 組織塊法體外常規(guī)培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，同時利用Ficoll-Paque Plus淋巴分離液分離人外周血單個核細(xì)胞。在含有1×10-

8、8mol/L1α，25-（OH）2D3與1×10-7mol/L地塞米松的培養(yǎng)液中，將單個核細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)或與牙周膜成纖維細(xì)胞直接共培養(yǎng)18天，同時設(shè)置rhBMP-2（+）和rhBMP-2（-）組，以后每3天進(jìn)行換液，每次半換液，觀察TRAP陽性單個核細(xì)胞和TRAP陽性多核破骨樣細(xì)胞的數(shù)量，并且分析rhBMP-2和人牙周膜成纖維細(xì)胞對其影響。 結(jié)果: （1）通過TRAP染色法和牙本質(zhì)上的骨吸收陷窩證明了人牙周膜成纖維細(xì)胞

9、和外周血單個核細(xì)胞直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨樣細(xì)胞的模型是可行的； （2）共培養(yǎng)體系中，rhBMP-2（+）組與rhBMP-2（-）組的TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)目相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=71.070，P<0.001）；共培養(yǎng)組與單個核細(xì)胞組之間的TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)目相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=39.000，P<0.001）；共培養(yǎng)組受rhBMP-2誘導(dǎo)后，TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)目顯著增加（t=17.079，P<0.001）

10、； （3）rhBMP-2與人牙周膜成纖維細(xì)胞在TRAP陽性多核細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用；同時，rhBMP-2與人牙周膜成纖維細(xì)胞聯(lián)合作用能促進(jìn)TRAP陽性多核細(xì)胞的生成。 結(jié)論： （1）在與人牙周膜成纖維細(xì)胞直接共培養(yǎng)的前提下，人外周血單個核細(xì)胞可分化為TRAP陽性的破骨樣細(xì)胞； （2）rhBMP-2有促進(jìn)破骨樣細(xì)胞生成的作用，其作用機(jī)制可能是通過人牙周膜成纖維細(xì)胞間接作用于人外周血單個核細(xì)胞。

11、二、人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL的表達(dá)以及rhBMP-2對其表達(dá)的影響。 目的: （1）檢測人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG和RANKL在基因水平和蛋白水平的表達(dá)； （2）觀察rhBMP-2對人牙周膜成纖維細(xì)胞中OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響，從而探討rhBMP-2對破骨樣細(xì)胞生成的作用機(jī)制。 方法: 采用組織塊法體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，選取生長狀態(tài)較好的細(xì)胞，利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測正?；A(chǔ)狀

12、態(tài)下，人牙周膜成纖維細(xì)胞上RANKL蛋白的表達(dá)，以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗（ELISA）檢測OPG蛋白的表達(dá)。然后利用100ng/mlrhBMP-2對人牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于誘導(dǎo)3d、6d、9d、12d、15d、18d時收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，檢測分泌型OPG蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果: （1）人牙周膜成纖維細(xì)胞膜上和胞漿中表達(dá)RANKL蛋白，符合其跨膜蛋白的特征；同時也分泌OPG蛋白到培養(yǎng)液中； （2）在18天的誘導(dǎo)

13、周期中，雖然OPG蛋白的分泌量由于細(xì)胞增殖呈升高趨勢，但rhBMP-2（+）組的增長趨勢低于rhBMP-2（-），說明rhBMP-2的誘導(dǎo)可顯著減少OPG蛋白的分泌（F=45.433，P<0.001）。 結(jié)論： （1）在正常的基礎(chǔ)狀態(tài)下，人牙周膜成纖維細(xì)胞能可表達(dá)OPG和RANKL； （2）rhBMP-2的誘導(dǎo)影響OPG蛋白的表達(dá)，推測其可能通過OPG/RANKL通路來影響人牙周膜成纖維細(xì)胞參與的破骨樣細(xì)胞的活化