重組人骨形成蛋白復(fù)性探討及重組人骨形成蛋白4二連體對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的作用.pdf

1、本文進(jìn)行了三個(gè)部分的研究：進(jìn)一步探討了骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)的復(fù)性方法；構(gòu)建人骨形成蛋白4成熟肽二連體，并初步探討輻射損傷造血后，它在造血系統(tǒng)修復(fù)中所起的作用。 第一部分：重組人骨形成蛋白(rhBMP)復(fù)性與活性的探討。目前基因工程制備BMPs的表達(dá)系統(tǒng)分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的BMPs具有良好的生物活性，但表達(dá)量低，表達(dá)產(chǎn)物回收、純化困難、生產(chǎn)成本很高

2、，這就使得BMPs的價(jià)格非常昂貴，難以在臨床廣泛使用。原核表達(dá)系統(tǒng)，特別是大腸桿菌系統(tǒng)，是經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)，與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有表達(dá)效率高，容易操作，容易監(jiān)控，產(chǎn)物穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。但原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過正確復(fù)性后才能具有生物活性。 探討了rhBMP2m的復(fù)性方法，采用了三種不同方案，并通過整體實(shí)驗(yàn)檢查了復(fù)性蛋白的誘骨活性。 (1)pH4.8復(fù)性液中透析復(fù)性，復(fù)性后得到的rhBMP2m蛋白可溶性好

3、，通過除菌微孔濾膜基本沒有吸附損失。所得復(fù)性蛋白液濃度較高(4.8mg/mL)，通常不必再濃縮就可以使用。直接將復(fù)性所得可溶性蛋白液注射入小鼠肌袋，不能誘導(dǎo)骨質(zhì)生成。蛋白液凍干后，溶解較慢。不加任何載體吸附，1mgrhBMP2m植入小鼠肌袋，三周誘導(dǎo)生成軟骨，四周成骨。表明其具有誘導(dǎo)異位成骨的活性，但誘骨活性不強(qiáng)。 (2)pH6.5復(fù)性液中透析復(fù)性，復(fù)性后蛋白不可溶。不加任何載體吸附，1mgrhBMP2m植入小鼠肌袋，兩周誘導(dǎo)生

4、成骨小梁，并有骨髓樣細(xì)胞出現(xiàn)。表明其誘骨活性很強(qiáng)。 (3)pH9.0復(fù)性液中稀釋復(fù)性，復(fù)性后蛋白可溶。蛋白液濃度低(＜200μg/ml)，需濃縮處理，但超濾濃縮時(shí)蛋白損失嚴(yán)重，反映了所復(fù)性的rhBMP2m疏水性強(qiáng)、溶解度低的特點(diǎn)。蛋白液凍干后，成不溶性。不加任何載體吸附，1mgrhBMP2m植入小鼠肌袋，兩周誘導(dǎo)軟骨生成，三周出現(xiàn)骨小梁。表明其誘骨活性一般。 上述3種復(fù)性方法差別很大，所得到的復(fù)性產(chǎn)物性質(zhì)和活性也很不相同

5、，但可以看到：復(fù)性后的不溶性rhBMP2m有強(qiáng)的誘導(dǎo)異位成骨活性，而可溶性rhBMP2m都沒有誘導(dǎo)異位成骨的活性。因而用于誘導(dǎo)成骨時(shí)，應(yīng)該使rhBMP2m成為不溶狀態(tài)；而以往的實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)要發(fā)揮其誘導(dǎo)造血活性時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用其可溶形式。 第二部分：重組人骨形成蛋白4成熟肽二連體(rdhBMP-4m)的設(shè)計(jì)和制備。 對(duì)BMP4成熟肽基因的原核表達(dá)及復(fù)性的研究已有報(bào)道，同BMP2一樣，大腸桿菌表達(dá)的rhBMP4m單體，需經(jīng)體外復(fù)

6、性，以獲得rhBMP4m二聚體。二聚體是BMP的活性形式，其單體內(nèi)含有3對(duì)二硫鍵，而兩個(gè)單體間由一對(duì)二硫鍵連接，BMP的復(fù)性包括這7對(duì)二硫鍵形成及BMP分子的正確折疊。其中形成分子間二硫鍵的半胱氨酸位于單體分子的末端，形成二硫鍵使兩個(gè)單體首尾相連，形成二聚體。其中分子間二硫鍵的形成尤為重要，是BMP復(fù)性的關(guān)鍵所在，這就使得其復(fù)性過程變得更加復(fù)雜和困難。 針對(duì)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)用基因工程手段使大腸桿菌直接表達(dá)有類似二聚體結(jié)構(gòu)，稱之為基

7、因重組骨形成蛋白4二連體(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-4maturepeptideduplex，rdhBMP-4m)。構(gòu)建方案是：利用PCR定點(diǎn)突變方法對(duì)編碼rhBMP-4m肽鏈的cDNA進(jìn)行定點(diǎn)突變，突變掉形成單體間二硫鍵的半胱氨酸，使2個(gè)rhBMP-4m間不以雙硫鍵(-S-S-)，而是通過增加一段連接肽以肽鍵(-CO-NH-)將兩個(gè)單體直接首尾相連接，原核細(xì)胞表達(dá)后直接生成類似二

8、聚體的結(jié)構(gòu)。連接肽大部分是由甘氨酸和絲氨酸組成，因?yàn)楦拾彼崴M成的肽鍵有對(duì)稱性的碳原子，可以任意轉(zhuǎn)動(dòng)，有利于蛋白分子的復(fù)性，但甘氨酸集團(tuán)為疏水性，可以埋入蛋白質(zhì)分子中，使其結(jié)構(gòu)受到影響，絲氨酸帶羥基為親水性氨基酸，與甘氨酸搭配可以增加連接肽的親水性從而使連接肽獨(dú)立于蛋白分子之外，不會(huì)影響蛋白的三維結(jié)構(gòu)。 成功構(gòu)建pDH2-rdhBMP-4m表達(dá)載體，DNA序列實(shí)際測(cè)定結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)的完全一致。將pDH2-rdhBMP-4m轉(zhuǎn)入E

9、.coliDH5α，成功構(gòu)建得穩(wěn)定傳代和表達(dá)的pDH2-rdhBMP-4m/DH5α工程菌株。 將rdhBMP-4m/DH5α工程菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵、溫度誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定發(fā)酵菌液OD600值為49.0，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，目的蛋白占細(xì)菌總蛋白量的29％；離心收集菌體，經(jīng)裂菌、超聲洗滌四次后，包涵體中目的蛋白的純度為65％；離子交換柱層析后得到純度為96％的rdhBMP-4m。采用與rhBMP2m相同的復(fù)性方法，得到可溶性的r

10、dhBMP-4m。 第三部分：重組人骨形成蛋白4成熟肽二連體對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)修復(fù)的作用。 造血器官是輻射敏感組織，電離輻射主要損傷有增殖能力的造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和幼稚血細(xì)胞，使造血細(xì)胞直接致死或誘導(dǎo)凋亡，從而導(dǎo)致造血細(xì)胞的增殖和更生障礙。CD34是造血細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD34+的百分比能夠反映骨髓造血系統(tǒng)的狀況。多種造血因子能增加CD34+細(xì)胞的數(shù)量，提高骨髓的造血功能。我們以前的研究已經(jīng)報(bào)道致死劑量照射的小鼠，用

11、可溶性rhBMP-2m治療，能促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖和造血系統(tǒng)的恢復(fù)，顯著提高極重度急性造血型放射病小鼠的存活率。BMP4作為造血因子，對(duì)胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用，能夠促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化，使骨髓保持旺盛的增殖能力。但BMP4對(duì)損傷的造血系統(tǒng)是否有修復(fù)作用，目前尚無報(bào)道。由本研究組首次構(gòu)建具有與rhBMP4m二聚體類似的結(jié)構(gòu)的rdhBMP-4m，是否具有活性，也必需通過實(shí)驗(yàn)觀察。 實(shí)驗(yàn)觀察了rdhBMP-4m對(duì)輻射致骨髓損傷小鼠

12、造血系統(tǒng)功能修復(fù)的作用。7.0Gy60Coγ射線照射，造成小鼠急性重度造血型放射病。(1)從d1起，治療組腹腔注射rdhBMP-4m(0.5mg/1.0ml/只)，照射對(duì)照組注射生理鹽水(1.0ml/只)，連續(xù)注射6天。分別于第1、3、5、7、9天檢測(cè)外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)、CD34+細(xì)胞百分率；第9天進(jìn)行CFU-S計(jì)數(shù)；連續(xù)飼養(yǎng)30天觀察小鼠存活率。正常小鼠白細(xì)胞數(shù)為(7.30±0.23×109*L-1)，60Coγ照射后迅

13、速減少，第5天降到最低點(diǎn)，對(duì)照組為(1.18±0.23×109*L-1)，治療組為(1.27±0.22×109*L-1)，均明顯低于正常水平。治療后，從第7天開始，外周血白細(xì)胞數(shù)逐漸增加，并顯著高于對(duì)照組。第7天，治療組為(2.41±0.24×109*L-1)，相比對(duì)照組(1.35±0.29×109*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)；第9天，治療組為(3.8±0.23×109*L-1)，相比對(duì)照組(1.93±0.20×10

14、9*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)。(2)正常小鼠單個(gè)核細(xì)胞數(shù)為(14.58±1.32×106*L-1)，60Coγ照射后迅速減少，第1天為(2.51±0.60×106*L-1)，明顯低于正常水平。治療后，單個(gè)核細(xì)胞逐漸增加，從第7天開始顯著高于對(duì)照組。第7天治療組為(5.31±0.34×106*L-1)，相比對(duì)照組(4.01±0.24×106*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)；第9天治療組為(6.74±0

15、.36×106*L-1)，相比對(duì)照組(4.42±0.26×106*L-1)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)。(3)正常小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞百分率為(7.12±0.25％)，60Coγ照射后迅速降低，第1天為(1.31±0.22％)，明顯低于正常水平。治療后，CD34+細(xì)胞百分率逐漸增加，從第7天開始顯著高于對(duì)照組。第7天，治療組為(3.21±0.23％)，相比對(duì)照組(2.30±0.21％)，差異有顯著性(P＜0.05

16、，n=6)；d9，治療組為(3.97±0.31％)，相比對(duì)照組(2.53±0.28％)，差異有顯著性(P＜0.05，n=6)。(4)第9天處死小鼠，將脾臟固定染色并記數(shù)，治療組CFU-S數(shù)為(40.5±3.8)，相比照射對(duì)照組(14.17±1.8)，差異有顯著性(P＜0.01，n=6)。(5)照射后30天治療組存活率為(40％)，對(duì)照組為(15％)，差異有顯著性(P＜0.05，n=20)。60Coγ射線照射后，經(jīng)rdhBMP4m治療，促