重組人成骨蛋白-1植入劑的制備及安全性評價.pdf

1、研究目的： 在本實驗室已構(gòu)建的工程菌rhOP-1/pBV221/E.coliDH5α的基礎(chǔ)上，經(jīng)發(fā)酵、純化、復(fù)性獲得高純度的有活性的rhOP-1。本項工作旨在利用明膠海綿(國藥準(zhǔn)字H32024096)作為載體制備rhOP-1植入劑型，研究其植入體內(nèi)異位成骨活性，并按照國家藥品審評中心制定的治療用生物制品非臨床安全性技術(shù)評審一般原則的要求，模擬臨床用藥觀察rhOP-1/明膠海綿植入劑的免疫原性、肌肉刺激性和毒性反應(yīng)，對rhOP-1

2、/明膠海綿植入劑進(jìn)行安全性評價，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 研究方法： (1)發(fā)酵的rhOP-1工程菌經(jīng)超聲裂解法破裂，多次洗滌后收集包涵體，用含有8mol/L尿素的包涵體溶解液溶解目的蛋白，經(jīng)SP-Sepharose和SephacrylS-100純化后進(jìn)行梯度透析復(fù)性。為進(jìn)一步提高二聚體的純度，復(fù)性后的rhOP-1用DEAFSepharose凝膠柱分離單體和二聚體。 (2)將吸收性明膠海綿加工成直徑為5mm

3、、厚度為2mm的圓片狀，與透析復(fù)性的rhOP-1混勻后置于冷凍干燥機(jī)中凍干，使rhOP-1干粉充分吸附在明膠海綿載體上，制備rhOP-1/明膠海綿植入劑植入小鼠股部肌間隙。分別設(shè)立載體對照組和實驗組，于2周、3周、4周時取材，對埋植樣品進(jìn)行鈣含量檢測和組織病理學(xué)檢查，觀察rhOP-1體內(nèi)異位成骨活性。并把明膠海綿載體與不同劑量的rhOP-1復(fù)合，研究rhOP-1植入劑量與骨誘導(dǎo)活性的量效關(guān)系。 (3)考察以明膠海綿為載體的rhO

4、P-1植入劑的免疫原性及肌肉刺激性。設(shè)空白對照組、陽性對照組和實驗組，將樣品植入小鼠股部肌間隙，于術(shù)后1周、2周、3周、4周時分別對6只小鼠眼球取血，分離血清，以間接ELISA方法檢測血清中的免疫原性，并對取材樣品做HE病理切片觀察周圍肌肉的形態(tài)變化。 (4)考察以明膠海綿為載體的rhOP-1植入劑的急性、長期毒性作用。設(shè)載體對照組和高、中、低三個劑量實驗組，急性毒性實驗觀察兩周，主要觀察動物外觀體征、行為活動、攝食量、排泄物的

5、變化及動物的死亡情況。長期毒性實驗在兩周、四周取材時觀察血液、血生化指標(biāo)的改變，對主要臟器做HE病理切片觀察組織形態(tài)改變，并計算臟器系數(shù)。 研究結(jié)果： (1)菌體經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白約占菌體蛋白總量的35％，經(jīng)SP-Sepharose和SephacrylS-100純化后，rhOP-1單體純度高達(dá)98％以上，純化后的rhOP-1經(jīng)梯度透析的方法復(fù)性，rhOP-1以單體和二聚體的形式存在。為提高

6、rhOP-1二聚體的純度，將復(fù)性后的rhOP-1用DEAE-Sepharose進(jìn)一步分離，二聚體的含量由復(fù)性后的48％提高到97％以上。 (2)rhOP-1復(fù)合明膠海綿能體內(nèi)異位誘導(dǎo)成骨，鈣含量檢測結(jié)果表明rhOP-1復(fù)合明膠海綿組高于單純載體組。組織學(xué)觀察到rhOP-1的骨誘導(dǎo)活性隨著時間的延長，骨小梁、編織骨、骨髓腔的生成面積也逐漸增大，明膠海綿載體的緩釋作用得以發(fā)揮。此外，鈣含量和組織學(xué)檢測結(jié)果均證實rhOP-1骨誘導(dǎo)活性

7、隨著植入劑量的增加而增強(qiáng)，rhOP-1植入劑量與其骨誘導(dǎo)活性正相關(guān)。 (3)間接ELISA結(jié)果表明此植入劑未引起小鼠的特異性抗體產(chǎn)生，植入部位肌肉雖出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，但隨著時間的延長炎癥反應(yīng)逐漸減輕消散，未發(fā)現(xiàn)肌肉組織的壞死。 (4)急性毒性實驗中未發(fā)現(xiàn)動物死亡，各組小鼠精神狀況好，恢復(fù)較快，進(jìn)食量、飲水量及排泄物未見明顯差異。主要臟器的組織學(xué)檢查鏡下未見病理形態(tài)異常改變。長期毒性實驗中，2周取材時血生化指標(biāo)中除蛋白含