重組人成骨蛋白-1植入劑的制備及誘骨活性研究.pdf

1、目的： 骨缺損的治療一直是骨科臨床的難題。骨缺損的治療目前主要是自體骨及異體骨的移植。但它們具有明顯的缺點(diǎn)，如自體骨來(lái)源有限，需要兩次手術(shù)；而異體骨具有免疫排斥和疾病傳播的缺陷等。骨組織的修復(fù)一般認(rèn)為是特定的靶細(xì)胞在特定環(huán)境中經(jīng)一定的生長(zhǎng)因子刺激發(fā)生增殖、分化的結(jié)果，即骨形成需要三個(gè)條件：1、靶細(xì)胞，即具有潛在骨生成能力的未分化間充質(zhì)細(xì)胞：2、具有骨誘導(dǎo)活性的因子：3、骨形成的適宜環(huán)境。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特別是基因工程技術(shù)的成

2、熟，骨生長(zhǎng)因子制備技術(shù)日臻完善及它的基礎(chǔ)與臨床研究日益深入，為骨缺損的治療提供了新的途徑。 作為骨誘導(dǎo)因子之一的成骨蛋白-1(osteogenic protein-1，OP-1)，又名骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)，具有強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)活性，能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化。OP-1還能彌補(bǔ)自體骨和異體骨移植的缺陷，在骨缺損、骨不連、脊柱融合術(shù)、矯形缺陷

3、等治療中發(fā)揮重要作用：此外，OP-1在口腔牙周再造、牙槽骨的發(fā)育和重建中也發(fā)揮重要作用。 由于單純r(jià)hOP-1在體內(nèi)容易擴(kuò)散、降解，在有效的時(shí)間內(nèi)無(wú)法作用于更多的靶細(xì)胞，因此，rhOP-1的穩(wěn)定緩慢釋放是其成骨作用的前提，rhOP-1緩釋載體是其發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。理想的載體除能承載rhOP-1并保持其活性外，尚具有良好的生物相容性、同時(shí)能保持適當(dāng)?shù)目障堵识诔晒羌?xì)胞爬行。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了工程菌rhOP-1/pBV221/E．

4、coli DH5a和rhOP-1/pBV221/E．coli BL 21，探索并建立了發(fā)酵、純化、復(fù)性等rhOP-1制備工藝，獲得了高純度的有活性的rhOP-1，實(shí)驗(yàn)室其他作者已經(jīng)探索了其與部分載體材料的復(fù)合。前期的實(shí)驗(yàn)證明，rhOP-1/明膠海綿植入劑在小動(dòng)物上具有良好的骨誘導(dǎo)活性。 本工作以臨床應(yīng)用為目的，針對(duì)臨床口腔科適應(yīng)癥，選擇易生物降解的生物工程材料，以實(shí)驗(yàn)室已有工藝制備rhOP-1復(fù)合植入劑，選擇與人更接近的大動(dòng)物進(jìn)

5、一步驗(yàn)證其骨誘導(dǎo)性，并探討其骨誘導(dǎo)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。 研究方法： 1．rhOP-1/明膠海綿植入劑制備發(fā)酵基因工程技術(shù)構(gòu)建的工程菌rhOP-1/pBV221/E．coli BL 21和OP-1/pBV221/E．coli DH5a，經(jīng)超聲裂解法破裂后收集包涵體，通過(guò)SP-Sepharose純化后進(jìn)行梯度透析復(fù)性，純化獲得高純度的rhOP-1。將吸收性明膠海綿加工成直徑為5mm、厚度為2mm的圓片狀，與透析復(fù)性

6、的rhOP-1混勻后置于冷凍干燥機(jī)中凍干，使rhOP-1干粉充分吸附在明膠海綿載體上，制備rhOP-1/明膠海綿植入劑。 2．rhOP-1植入劑對(duì)牙槽骨再生的作用本實(shí)驗(yàn)將rhOP-1植入劑應(yīng)用于犬拔牙創(chuàng)的研究，分別設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，于2周、4周、8周時(shí)取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察、X線檢測(cè)和組織學(xué)檢查，觀察rhOP-1體內(nèi)誘導(dǎo)成骨活性。 3．rhOP-1對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)方法獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

7、，分別設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，利用rhOP-1對(duì)其誘導(dǎo)分化，進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色觀察rhOP-1體內(nèi)誘導(dǎo)成骨活性。 4．rhOP-1植入劑對(duì)成骨組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組學(xué)是以基因組編碼的全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，旨在從分子水平及整體水平研究蛋白質(zhì)的組成及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，從而深入認(rèn)識(shí)有機(jī)體的各種生理和病理過(guò)程。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙向電泳技術(shù)研究了rhOP-1/明膠海綿復(fù)合體埋植于肌肉組織后對(duì)成骨組織的蛋

8、白質(zhì)組學(xué)研究。 研究結(jié)果： 1．菌體經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白約占菌體蛋白總量的30％，經(jīng)SP-Sepharose純化后，rhOP-1單體純度高達(dá)90％以上，純化后的rhOP-1經(jīng)梯度透析的方法復(fù)性，rhOP-1以單體和二聚體的形式存在。 2．rhOP-1植入劑具有明顯的促進(jìn)牙槽骨再生的作用，并且可以縮小拔牙創(chuàng)，減少出血，從而促進(jìn)拔牙創(chuàng)的愈合，可以為早期義齒修復(fù)、早期牙種植做準(zhǔn)備，而且該材

9、料制作方便，操作簡(jiǎn)單，有望經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究成為臨床促牙槽骨再生的生物材料。 3．rhOP-1成骨作用明顯，在體外有良好的骨誘導(dǎo)活性，為其在組織工程學(xué)方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。 4．實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為732個(gè)和784個(gè)。這些蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量分布范圍較廣，蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布在等電點(diǎn)為4-7，分子量為24kD-66kD的范圍。分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間存在差異蛋白質(zhì)點(diǎn)共92個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中28個(gè)點(diǎn)