重組人骨形成蛋白-2結(jié)合膠原骨粉-無膠原骨粉在兔股骨遠端標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型中成骨效能的研究.pdf

1、研究背景:
　　 外傷、腫瘤、感染等因素導(dǎo)致大量的骨缺損,骨缺損的修復(fù)與重建依然是臨床難題。自體骨移植由于同時具備骨生成、骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、可吸收、可重建特性,被認(rèn)為是最好的骨移植材料,但由于供骨量有限,供區(qū)發(fā)病等缺陷而限制了其臨床應(yīng)用,促使人們尋找可以取代自體骨的骨組織替代材料,骨組織替代材料的研究開發(fā)成為目前骨組織工程研究重點關(guān)注的內(nèi)容。
　　 骨組織工程材料首先要考慮其骨誘導(dǎo)性和骨引導(dǎo)性。骨誘導(dǎo)件是指移植骨能誘導(dǎo)宿主

2、間充質(zhì)細(xì)胞聚集并分化為成骨細(xì)胞形成新骨;骨引導(dǎo)性是指移植骨能提供支架結(jié)構(gòu)引導(dǎo)血管和成骨細(xì)胞長入移植骨形成新骨。目前多數(shù)骨組織替代材料僅具有骨引導(dǎo)特性,臨床使用時常限于較小的骨缺損。牛骨是目前研究和應(yīng)用最廣泛的異種骨材料,有骨引導(dǎo)作用,但無骨生成作用及骨誘導(dǎo)作用,其主要成分是羥基磷灰石。
　　 具有誘導(dǎo)成骨作用的物質(zhì)包括骨形成蛋白等被認(rèn)為是替代自體骨移植最有前途的替代物。隨著基因工程的發(fā)展,目前已研制出活性好、成本低的rhBMP-

3、2,使BMP-2的來源得到了初步解決。rhBMP-2單獨使用時易分散和降解,成骨效能低,使用時需要與載體結(jié)合。
　　 在骨組織工程中,目前亟待解決的問題是如何選擇理想的生物活性材料及其載體,因為只有具備高度成骨能力的生物活性材料和良好緩釋功能的載體以一定方式相結(jié)合才能最大限度地發(fā)揮各自的功能,有效地促進骨生長。
　　 大量的載體被研究開發(fā),膠原是骨組織的基本成分,由于它的功能多樣性,良好的生物相容性及較低的免疫原性,被認(rèn)

4、為是BMP最理想的載體之一。研究表明,單獨膠原的成骨能力是有限的。本實驗所用rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉,是把含七個氨基酸的寡肽即膠原結(jié)合域和rhBMP-2的N端結(jié)合,實現(xiàn)rhBMP-2與膠原的緊密結(jié)合,從而固定在帶膠原小牛骨上。膠原與rhBMP復(fù)合保護rhBMP不至擴散太快,使rhBMP在較長時間內(nèi)在局部保持較高濃度而發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用,以促進rhBMP活性的發(fā)揮。
　　 為充分了解骨組織替代材料生物學(xué)性能及實驗結(jié)果的可靠性,建立合

5、適的骨缺損動物模型是研究骨組織替代材料的前提。但很少有研究者對實驗動物模型給予充分關(guān)注。骨組織替代材料在不同的動物模型及解剖部位成骨情況是不同的。本實驗通過對兔股骨遠端干骺端解剖結(jié)構(gòu)的分析,以及對骨組織替代材料在該骨缺損模型中的應(yīng)用觀察,探討該標(biāo)準(zhǔn)承重骨缺損動物模型的優(yōu)點和可行性,為理想骨缺損動物模型帶來新的思路。
　　 目的:
　　 1.探討兔股骨遠端標(biāo)準(zhǔn)骨缺損動物模型的優(yōu)點及在骨組織替代材料研究應(yīng)用的可行性及科學(xué)性,

6、為組織工程理想動物模型提供新的思路
　　 2.研究重組人骨形成蛋白-2與膠原結(jié)合后對成骨效能的影響
　　 3.初步探討具有骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)活性的新型骨移植材料的成骨效能
　　 方法:
　　 1.實驗動物及分組
　　 (1)第一部分實驗
　　 15只成年健康新西蘭大白兔,隨機分為2組。實驗組12只動物,觀測時間為2、4、6、12周,每組每個時間段各3只動物6個標(biāo)本,觀察骨組織替代材料在各時間段

7、的成骨效能及降解情況。對照空白組3只動物6個標(biāo)本,觀察12周時骨缺損愈合情況。
　　 (2)第二部分實驗
　　 72只成年健康新西蘭大白兔,隨機分為6組:A、B、C、D、E、F,每組有12只動物24個標(biāo)本。A組植入植入無膠原骨粉;B組植入植入膠原骨粉;C組植入游離rhBMP-2膠原骨粉；D組植入rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉；E組植入rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉;F組植入rhBMP-2結(jié)合膠原

8、骨粉與無膠原骨粉體積1:3均勻混合骨粉。
　　 2.手術(shù)過程及實驗動物模型的建立
　　 所有動物均選雙側(cè)股骨遠端干骺端施術(shù),建立直徑6mm,深度10mm的骨缺損,按分組分別植入相應(yīng)的骨組織替代材料。
　　 3.主要檢測分析方法
　　 通過大體觀察,放射線觀察,股骨遠端干骺端解剖學(xué)測量及組織學(xué)切片觀察新生骨形成情況及骨缺損愈合情況,采用SPSS13.0對各時間段相關(guān)實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)

9、果:
　　 1.實驗動物術(shù)后生長恢復(fù)良好,無死亡動物,未見病理性骨折。按照實驗分組在各時間段每組各時間段處死3只動物,各得6個標(biāo)本。
　　 2.標(biāo)本大體觀察可初步評價骨組織替代材料修復(fù)降解能力及骨缺損區(qū)愈合情況。根據(jù)放射影像密度的不同時點表現(xiàn),可以對比骨組織替代材料降解吸收情況及骨缺損愈合情況,同時可以觀察新骨沿骨粉邊緣生成。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果:經(jīng)析因方差分析,各組間新生骨面積百分比有顯著性差異(F=93

10、.681,P=0.000),各時間段新生骨面積百分比有顯著性差異(F=149.197,P=0.000)。處理組間與時間段間交互效應(yīng)顯著(F=13.294,P=0.000)。
　　 各時間段組間的兩兩比較,2周時,數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計對比分析后顯示B組與C組新生骨面積白分比數(shù)據(jù)比較(P=0.218),差異無統(tǒng)計學(xué)意義;C組與E組數(shù)據(jù)比較(P=0.292),差異無統(tǒng)計學(xué)意義,E組與F組數(shù)據(jù)比較(P=0.377),差異無統(tǒng)計學(xué)意義;其余各組兩

11、兩間比較P值均小于0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)上意義。A組無膠原骨粉組,B組膠原骨粉組,C組游離rhBMP-2膠原骨粉組,D組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉組,E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組,F組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉1:3均勻混合骨粉組各組新生骨面積百分比分別為 15.22±2.44,21.18±1.9,22.93±2.56,30.21±2.35,21.44±2.81,20.19±2.3?？?/p>

12、見2周時,D組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉組新生骨面積百分比最高,A組無膠原骨粉組新生骨面積百分比最小。
　　 4周時,各組新生骨面積百分比數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計對比后顯示,B組與C組及F組統(tǒng)計對比顯示P值均大于0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;C組與F組相比(P=0.289),差異無統(tǒng)計學(xué)意義;其余各組兩兩間比較P值均小于0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)上意義。A組無膠原骨粉組,B組膠原骨粉組,C組游離rhBMP-2膠原骨粉組,D組rhBMP-2結(jié)合膠

13、原小牛骨骨粉組,E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組,F組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉1:3均勻混合骨粉組各組新生骨面積百分比分別為19.12±2.02,26.92±1.78,25.16±2.18,35.98±1.68,30.08±1.93,26.63±3.82?？梢?周時D組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉組新生骨面積依然最高,E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組在此期也

14、開始表現(xiàn)出較強的成骨效應(yīng),其新生骨面積百分比僅次于D組,而高于其余A,C,E,F組。
　　 6周時,數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計對比后顯示,A組與C組之間數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(P=0.665),差異無統(tǒng)計學(xué)意義;D組與F組比較(P=0.327),差異無統(tǒng)計學(xué)意義:其余各組兩兩間比較P值均小于0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)上意義。A組無膠原骨粉組,B組膠原骨粉組,C組游離rhBMP-2膠原骨粉組,D組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉組,E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉

15、與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組,F組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉1:3均勻混合骨粉組各組新生骨面積百分比分別為21.42±1.95,26.56±1.14,21.98±1.89,32.42±1.95,38.18±2.09,31.14±3.55。E組重組人骨形成蛋白-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組成骨最多。
　　 12周時,B組膠原骨粉組,C組游離rhBMP-2膠原骨粉組,D組rhBMP-2結(jié)合膠

16、原骨粉組骨粉基本降解完全,同時新生骨質(zhì)伴隨吸收,而A組無膠原骨粉組,E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組,F組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉1:3均勻混合骨粉組新生骨進一步增加,故僅對該3組新生骨面積百分比進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析對比后顯示P值均小于0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)上意義。A組無膠原骨粉組,E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組,F組rhBMP-2結(jié)合膠原

17、骨粉與無膠原骨粉1:3均勻混合骨粉組各組新生骨面積百分比分別為27.63±1.95,53.46±7.48,35.22±2.67。E組rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉與無膠原骨粉體積1:1均勻混合骨粉組依然表現(xiàn)出較強的成骨效應(yīng),新生骨量明顯高于其他各組。
　　 結(jié)論:
　　 1.兔股骨遠端干骺端骨缺損模型解剖部位固定,干骺線為術(shù)中重要參考標(biāo)記；主要在松質(zhì)骨區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)骨缺損,其空間是足夠的;該動物模型應(yīng)為骨組織替代材料用于大動物及

18、臨床前優(yōu)先選用的一種較理想標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型；
　　 2.rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉組在早期就表現(xiàn)出較強的成骨能力,表明具有良好的骨誘導(dǎo)特性;
　　 3.rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉組早期成骨效果優(yōu)于游離rhBMP-2膠原骨粉組;
　　 4.膠原在早期可促進成骨及促進骨組織替代材料的降解吸收;
　　 5.rhBMP-2結(jié)合膠原骨粉/無膠原骨粉混合表現(xiàn)出良好的骨誘導(dǎo)特性及骨引導(dǎo)特性,成骨效能增強；