骶韌帶成纖維細胞受力后細胞骨架系統(tǒng)變化的初步研究.pdf

1、目的:
　　 1、研究應變量不同的兩種機械力對盆腔器官脫垂(pelvicorganprolapse，POP)患者與非POP患者骶韌帶成纖維細胞骨架形態(tài)的影響及骨架蛋白中β-actin、β-tubulin與vinculin表達的調節(jié)。
　　 2、研究機械力與細胞骨架重塑的關系。
　　 3、從細胞骨架的變化探討機械力在女性盆腔器官脫垂(pelvicorganprolapse，POP)發(fā)病機制中的作用。
　　

2、方法:
　　 1、研究對象:選取2011年10月-2012年9月在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科接受手術治療的15例POP患者的骶韌帶為病例組;同期因子宮良性病變行子宮全切的15例非POP患者的骶韌帶作為對照組。兩組患者均無子宮內膜異位癥、糖尿病及呼吸、消化、心血管系統(tǒng)等影響細胞骨架代謝的疾病，術前3個月內未應用性激素治療。病例組與對照組在年齡、產(chǎn)次、孕次、體重指數(shù)等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 2、取材:經(jīng)河北醫(yī)科大

3、學第二醫(yī)院倫理委員會同意，所有患者簽署知情同意書。所取標本為兩組患者近宮頸部分的骶韌帶組織，4℃冷盒送實驗室，整個取材運輸過程小于2小時并要求嚴格無菌。
　　 3、成纖維細胞的原代培養(yǎng)和鑒定:采用組織塊法進行骶韌帶成纖維細胞的原代培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡、HE染色及瑞姬染色進行細胞形態(tài)學觀察，免疫細胞化學染色和免疫細胞熒光染色進行細胞鑒定。
　　 4、細胞力學實驗:采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加載系統(tǒng)，

4、分別對3～5代處于對數(shù)期生長的對照組及病例組骶韌帶成纖維細胞加力，加載過程在二氧化碳培養(yǎng)箱內進行。加載參數(shù):幅度10％與20％，正弦波，0.5Hz，加載時間分別為:0、4、12、24小時。在設定的時間將病例組與對照組的細胞培養(yǎng)板取出立即進行免疫熒光染色。在激光共聚焦顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下觀察不同機械力對兩組骶韌帶成纖維細胞骨架中F-actin的影響，同時用免疫蛋白印跡技術測定受力前后骨架蛋白中β-actin、β-tubulin與vin

5、culin表達含量的變化。所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計意義。
　　 結果:
　　 1、所培養(yǎng)細胞呈長梭形或不規(guī)則三角形，邊界清楚，約30天左右單層細胞達80％-90％匯合時呈放射狀或漩渦狀排列。免疫細胞化學染色及免疫細胞熒光染色波形蛋白表達陽性，角蛋白和平滑肌肌動蛋白表達陰性，結合取材部位證實為骶韌帶成纖維細胞。
　　 2、在機械力作用下骶韌帶成纖維細胞的形態(tài)及排列方式發(fā)生變

6、化，在10％應變下隨著受力時間的延長形態(tài)由原來的多形性成為單一的長梭形，排列方向趨于規(guī)則并垂直于最大應變方向，以24小時最明顯;20％應變下部分細胞發(fā)生斷裂及明顯的皺縮，失去了原有的形態(tài)。
　　 3、在激光共聚焦顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下可見FITC-phalloidin標記的細胞骨架微絲呈綠色熒光，PI標記的細胞核呈紅色熒光，未加力時兩組骶韌帶成纖維細胞熒光染色強，應力纖維清晰可見;在10％應變的作用下兩組骶韌帶成纖維細胞內微絲

7、纖維排列方向隨加力時間延長出現(xiàn)對力場順應性的變化，但其熒光標記強度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，4h時最弱，以后逐漸增強，于加力后24h熒光染色強度與靜態(tài)不加力組接近;在20％應變作用下，隨著加力時間的延長，細胞熒光強度持續(xù)減弱，于加力后24h可以清楚看到微絲結構破壞，部分崩解成團塊狀。此外，在不同應力的不同階段，對照組細胞骨架微絲的熒光染色強度普遍較病例組要高。
　　 4、Westernblot凝膠電泳結果顯示在10％應力作用下，對

8、照組及病例組骶韌帶成纖維細胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin的含量無明顯變化(P＞0.05)，而vinculin的表達水平隨加力時間的延長逐漸升高(P＜0.05);在20％應力作用下，兩組骶韌帶成纖維細胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin及vinculin的表達水平均呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢（P＜0.05）。此外，在不同應力的不同階段，對照組細胞骨架蛋白中β-actin、β-tubulin、vinculin的表達水平普遍

9、較病例組要高（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1、應變量不同的兩種機械力可以改變細胞的形態(tài)和伸展方向，分別對骶韌帶成纖維細胞骨架形態(tài)產(chǎn)生適應或破壞性的作用效果，并影響著骨架蛋白中β-actin、β-tubulin與vinculin的表達含量。
　　 2、機械力作用下的細胞骨架重塑在POP的的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，非POP患者較POP患者具有更穩(wěn)定的細胞骨架系統(tǒng)。
　　 3、機械力在POP發(fā)病機制