CLIC4參與上皮性卵巢癌腫瘤間質(zhì)相關(guān)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其microRNAs調(diào)控.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的惡性腫瘤，因為在其診斷時多數(shù)已為晚期病例，雖然經(jīng)過系統(tǒng)的手術(shù)、化學(xué)治療，5年生存率仍不超過45％，一直被認(rèn)為是一個“沉默殺手”。越來越多的學(xué)者認(rèn)識到，腫瘤的生物學(xué)行為不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身的特征，而且與腫瘤間質(zhì)之間的相互作用密切相關(guān)。不同的實體腫瘤雖然實質(zhì)和間質(zhì)的比例不盡相同，但是一般腫瘤的間質(zhì)成分占整個實體腫瘤的50-90％。間質(zhì)成分毗鄰于腫瘤細(xì)胞，受到腫瘤細(xì)胞旁分泌信號的調(diào)節(jié)，

2、可以轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)的間質(zhì)細(xì)胞，因為其改變了細(xì)胞的表型、功能和腫瘤局部的微環(huán)境，可以促進(jìn)腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和血管形成。腫瘤間質(zhì)的腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞是間質(zhì)細(xì)胞中最主要的細(xì)胞成分，其主要來源包括：腫瘤局部的纖維母細(xì)胞、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遠(yuǎn)處部位的纖維母細(xì)胞、骨髓祖細(xì)胞、干細(xì)胞等。其中，間質(zhì)纖維母細(xì)胞是最主要的細(xì)胞成分，其不同于正常的纖維母細(xì)胞，因為表達(dá)已分化肌纖維母細(xì)胞表型標(biāo)志α-SMA(α-smooth muscle actin)，被稱為腫

3、瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞(tumour-associated fibroblasts，myofibroblasts)，但其分子轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不完全清楚。對腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化激活機(jī)制的深入研究，將有助于靶向腫瘤間質(zhì)治療新策略的提出。
　　 細(xì)胞內(nèi)氯通道蛋白4(Chloride intracellular channel4，CLIC4)，是細(xì)胞內(nèi)的一種氯通道，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞體積。它不僅存在于細(xì)胞器膜上，而且可以以可溶性

4、成分存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，作為一種通道調(diào)節(jié)劑或信號蛋白。有研究顯示，TGF-β1可以刺激乳腺組織原位的纖維母細(xì)胞的CLIC4轉(zhuǎn)錄水平升高，更重要的是，CLIC4高表達(dá)于乳腺癌組織的間質(zhì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，而正常組織間質(zhì)中幾乎無CLIC4表達(dá)。故我們推測CLIC4可能參與上皮性卵巢癌的間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類分布廣泛的小的非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，其功能是負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)。在人類基因

5、組中至少存在700個miRNAs(也有可能為1000個)，約占人類基因的1-4％，預(yù)測他們能夠調(diào)節(jié)至少三分之一的人類基因，這使得其成為最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子。miRNAs參與生命過程中幾乎所有的重要過程，包括早期發(fā)育，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等。腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中存在一系列表型和功能基因的表達(dá)改變，但參與此過程調(diào)控基因表達(dá)的miRNAs尚未見報道。
　　 本研究中，我們首先檢測上皮性卵巢癌患者組織中CLIC4

6、的表達(dá)，并構(gòu)建間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型，探討是否CLIC4參與此轉(zhuǎn)化過程及其在此過程中的作用，進(jìn)一步探討調(diào)控腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的miRNAs。
　　 第一部分CLIC4介導(dǎo)卵巢癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　 目的：
　　 來自腫瘤與間質(zhì)相互作用的信號分子激活腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞，其對腫瘤的進(jìn)展起重要的作用。CLIC4可能參與間質(zhì)纖維母細(xì)胞的激活，但其分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討CLIC4是否參與上皮

7、性卵巢癌間質(zhì)纖維母細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其在此過程中的作用。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測上皮性卵巢癌組織間質(zhì)中CLIC4的表達(dá)。
　　 2.卵巢癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Conditioned medium，CM)或轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)培養(yǎng)原代卵巢正常纖維母細(xì)胞或人纖維母細(xì)胞系構(gòu)建卵巢癌腫瘤間質(zhì)纖維母細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的

8、細(xì)胞模型，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型標(biāo)志α-SMA表達(dá)上調(diào)，評價轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型成功構(gòu)建。
　　 3.應(yīng)用肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型，證實CLIC4和活性氧產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)參與此轉(zhuǎn)化過程。
　　 4.應(yīng)用CLIC4特異性siRNA阻斷CLIC4的表達(dá)，探討其在腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。
　　 5.應(yīng)用CLIC4特異性siRNA阻斷C

9、LIC4的表達(dá)或氯離子通道抑制劑抑制CLIC4的功能、抗氧化劑阻斷ROS水平上調(diào)，探討它們對腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)功能蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.上皮性卵巢癌組織中間質(zhì)CLIC4的陽性表達(dá)率為97.22％，肌纖維母細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA的陽性表達(dá)率為94.44％，兩者密切相關(guān)性(P＜0.05)。腫瘤間質(zhì)CLIC4表達(dá)強(qiáng)度與患者的腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，中、低分化者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者腫瘤組

10、織間質(zhì)CLIC4的表達(dá)明顯高于高分化，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。
　　 2.應(yīng)用卵巢癌細(xì)胞CM或TGF-β1培養(yǎng)卵巢組織原代正常纖維母細(xì)胞或人纖維母細(xì)胞系MRC-548小時，細(xì)胞增大呈多角形，而無血清培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞呈細(xì)長紡錘狀，同時α-SMA的轉(zhuǎn)錄(P＜0.05)和蛋白表達(dá)水平顯著增加，表明正常纖維母細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　 3.應(yīng)用卵巢癌細(xì)胞CM或TGF-β1培養(yǎng)卵巢組織原代正常纖維母細(xì)胞或人纖維母細(xì)胞系

11、MRC-548小時，纖維母細(xì)胞CLIC4表達(dá)在轉(zhuǎn)錄(P＜0.05)和蛋白水平明顯上調(diào)。
　　 4.應(yīng)用卵巢癌細(xì)胞CM或TGF-β1培養(yǎng)卵巢組織原代正常纖維母細(xì)胞或人纖維母細(xì)胞系MRC-5促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，應(yīng)用抗氧化劑抑制ROS產(chǎn)生可以抑制CM或TGF-β1誘導(dǎo)的CLIC4和α-SMA上調(diào)(P＜0.05)。
　　 5.應(yīng)用CLIC4特異性siRNA能夠有效阻斷CLIC4的表達(dá)，抑制CM或TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表

12、達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)。
　　 6.應(yīng)用CLIC4特異性siRNA阻斷CLIC4的表達(dá)或氯離子通道抑制劑抑制CLIC4的功能、抗氧化劑阻斷ROS水平上調(diào)，可以抑制與肌纖維母轉(zhuǎn)化相關(guān)促血管因子VEGFA和HGF mRNA水平表達(dá)29-80％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 CLIC4參與卵巢癌腫瘤間質(zhì)纖維母細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。來自腫瘤的旁分泌信號TGF-β1刺激使纖維母細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)而促進(jìn)C

13、LIC4的表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致纖維母細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的活化。阻斷CLIC4和ROS具有靶向腫瘤間質(zhì)的治療前景。
　　 第二部分microRNA-21參與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　 目的：
　　 腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β1誘導(dǎo)腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化表現(xiàn)為一系列表型和功能基因的表達(dá)改變。miRNAs作為重要的基因負(fù)性調(diào)節(jié)因子，目前參與腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的miRNAs尚未見報道。<

14、br>　　 方法：
　　 1.應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測一系列候選參與腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的miRNAs的表達(dá)水平。
　　 2.應(yīng)用microRNA-21(miR-21)抑制物和類似物轉(zhuǎn)染人纖維母細(xì)胞，探討miRNA-21在腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中的作用。
　　 3.應(yīng)用計算機(jī)軟件預(yù)測腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中miR-21的靶向調(diào)控基因，應(yīng)用構(gòu)建包含miR-21靶基因調(diào)控

15、程序性細(xì)胞死亡4基因(programmed cell death4，PDCD4)3'-UTR的熒光素酶報告載體方法和應(yīng)用轉(zhuǎn)染或敲除miR-21后檢測纖維母細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平的變化，確定PDCD4是否是miR-21在肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的靶向調(diào)節(jié)基因。
　　 結(jié)果：
　　 1.應(yīng)用卵巢癌細(xì)胞CM或TGF-β1培養(yǎng)人纖維母細(xì)胞系MRC-5，細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)，并且具有時間和劑量依賴性效應(yīng)。

16、
　　 2.應(yīng)用miR-21抑制物和類似物轉(zhuǎn)染纖維母細(xì)胞MRC-5，miR-21抑制物特異性降調(diào)而其類似物特異性上調(diào)miR-21的水平(P＜0.05)。miR-21抑制物可以抑制CM或TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中α-SMA等轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因和功能基因的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 3.生物信息軟件預(yù)測調(diào)控PDCD4的3'UTR與miR-21具有明顯的相互作用“種子序列”。
　　 4.構(gòu)建含有mi

17、R-21潛在結(jié)合位點的PDCD4基因3'UTR熒光素酶報告載體，其與miR-21抑制劑或模仿劑共轉(zhuǎn)染入纖維母細(xì)胞MRC-5，miR-21模仿劑增加miR-21的表達(dá)而抑制熒光素酶活性，而miR-21抑制劑顯著增加熒光素酶活性(P＜0.05)。提示，在纖維細(xì)胞中miR-21能夠結(jié)合到PDCD4基因的3'UTR。
　　 5.應(yīng)用特異性轉(zhuǎn)染或沉默方法，miR-21模仿劑和miR-21抑制劑分別降低和升高纖維母細(xì)胞中PDCD4的蛋白表達(dá)