卵巢癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性研究.pdf

1、研究背景：
　　 在世界范圍內(nèi)，卵巢癌是女性常見惡性腫瘤之一。2008年，全球估計新發(fā)的卵巢癌患者超過220，000例，死亡的患者約140，200例。在中國，卵巢癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性生殖道惡性腫瘤第三位，死亡率居首位。病理類型以卵巢上皮癌為主。卵巢癌多發(fā)生于中老年女性，診斷年齡50～70歲。因患者早期常無明顯癥狀，診斷時已多為晚期。且卵巢上皮癌具有嗜漿膜腔特性，易出現(xiàn)惡性腹腔積液，甚至胸腔積液，臨床治療存

2、在難點(diǎn)?；颊叩纳钯|(zhì)量受到嚴(yán)重影響，出現(xiàn)胸、腹腔積液的患者平均生存期不到1年。
　　 現(xiàn)今研究普遍認(rèn)為，惡性腫瘤的發(fā)生與機(jī)體免疫功能的抑制有著密切關(guān)聯(lián)。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是浸潤在腫瘤組織周圍的淋巴細(xì)胞，其受到腫瘤表面抗原的刺激而被激活，是近年來腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一。因機(jī)體免疫功能及局部微環(huán)境的影響，體內(nèi)腫瘤組織中存在的TIL數(shù)量較少，活力低下。已有研究表

3、明，TIL在體外可被白介素-2(Interleukin-2，IL-2)等細(xì)胞因子誘導(dǎo)活化并擴(kuò)增。繼Rosenberg等首次報道了TIL良好的抗腫瘤效果后，又有不少關(guān)于TIL臨床應(yīng)用于治療惡性腫瘤、惡性胸腹腔積液的研究見諸報道。 Fabbri等采用TIL/IL-2聯(lián)合治療39例腫瘤患者，其中惡性黑色素瘤18例，結(jié)腸癌19例，腎細(xì)胞癌2例。結(jié)果顯示:惡性黑色素瘤患者中，64.7％(11例)生存期超過37個月;結(jié)腸癌患者中，44.4％（8例）

4、生存期超過21個月;2例腎癌患者中，1例生存期超過28個月。全部患者中，惡性黑色素瘤和結(jié)腸癌各有1例完全治愈。林菁等應(yīng)用TIL/IL-2治療107例腫瘤惡性胸腔積液患者，其中肺癌74例，乳腺癌2例，肝癌4例，卵巢癌9例，胃癌2例，大腸癌3例，鼻咽癌2例，宮頸癌8例，其他3例。在可評價療效的104例患者中，70.2％(73/104)完全緩解，22.1％(23/104)部分緩解，總有效率達(dá)92.3％。王玉玲等報道TIL/IL-2聯(lián)合治療12

5、例晚期卵巢癌腹腔積液患者，總有效率達(dá)75％。
　　 腫瘤惡性胸腹腔積液的產(chǎn)生機(jī)制目前尚不十分明確，有待進(jìn)一步研究。除外惡性腫瘤胸腹腔、大網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)移浸潤，腫瘤細(xì)胞阻塞淋巴管導(dǎo)致回流障礙等原因外，有研究提示，腫瘤細(xì)胞可合成和分泌血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)。它們不僅與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相

6、關(guān)，還可促進(jìn)腫瘤血管生成、增加血管通透性，導(dǎo)致液體濾過增加，被認(rèn)為在惡性漿膜腔積液的形成中起著重要作用。TIL對控制惡性胸腹腔積液有良好療效，可能與減少VEGF和MMPs的合成、分泌相關(guān)。
　　 我們在臨床應(yīng)用過程中，從卵巢癌惡性胸腹腔積液分離獲得TIL，在體外應(yīng)用IL-2等多種細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)活化并大量擴(kuò)增，然后回輸?shù)叫厍弧⒏骨粌?nèi)，從而達(dá)到治療惡性胸、腹腔積液的目的?，F(xiàn)已觀察到TIL療法治療晚期卵巢癌胸腹腔積液確實(shí)有良好療效，

7、待進(jìn)一步研究TIL的體外分離培養(yǎng)，了解其生物學(xué)特性、治療機(jī)制等，同時結(jié)合腫瘤分子生物學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的療效評價，以期為臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 目的：
　　 研究卵巢癌TIL經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增前、后免疫表型及殺傷力的變化。探討TIL對自體腫瘤細(xì)胞的致凋亡作用。分析經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增的TIL處理后，自體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分子標(biāo)志物(CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9)的變化情況。通過上述研究對卵

8、巢癌TIL的體外抗腫瘤活性進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 1.卵巢癌自體腫瘤細(xì)胞、TIL的獲取及培養(yǎng)
　　 12例卵巢癌實(shí)體瘤組織，來自南方醫(yī)院婦產(chǎn)科新鮮手術(shù)標(biāo)本。所有患者，術(shù)前均未行抗腫瘤治療，術(shù)后均經(jīng)過組織病理學(xué)確診為卵巢上皮癌（病理類型為漿液性囊腺癌）。實(shí)體瘤組織經(jīng)機(jī)械剪切至小于1mm×1mm×1mm后，加入0.1％Ⅱ型膠原酶，4℃消化過夜，再加入0.02％透明質(zhì)酸酶、0.004％DNA酶于37℃聯(lián)合消化4

9、小時，100目、200目鋼篩過濾，獲得單細(xì)胞懸液。采用人淋巴細(xì)胞分離液(100％ Ficoll-Hypaque)，分步低速離心法、連續(xù)密度梯度離心法分離腫瘤細(xì)胞及TIL。分別采用加入20％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Hyclone)的RPMI-1640(Gibco)完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)卵巢癌自體腫瘤細(xì)胞;10％ FBS RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)TIL，后者同時加入2500U/ml IL-2。根據(jù)細(xì)胞生長

10、情況換液、傳代培養(yǎng)，TIL培養(yǎng)1～2天補(bǔ)充IL-2。
　　 2.細(xì)胞株的培養(yǎng)
　　 人白血病細(xì)胞株K562、人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji，均由南方醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室保存提供。使用10％ FBS RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況換液、傳代培養(yǎng)。
　　 3.自體腫瘤細(xì)胞鑒定
　　 采用蘇木素—伊紅染色(HE染色)觀察自體腫瘤細(xì)胞形態(tài)。檢測自體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤標(biāo)志物（CA-125、CA-

11、153、CA-199、CEA等），并與細(xì)胞來源患者血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行比較，對自體腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 4.TIL免疫表型的測定
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測TIL經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增第0天、第14天的免疫表型(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)。
　　 5.TIL殺傷力的檢測
　　 采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)，檢測TIL經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增第0天、第3天、第7天、第

12、14天對自體腫瘤細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞的殺傷力。
　　 6.經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增后的TIL對自體腫瘤細(xì)胞的致凋亡作用
　　 按照50∶1比例，應(yīng)用經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增第14天的TIL作為效應(yīng)細(xì)胞，處理自體腫瘤細(xì)胞（靶細(xì)胞）24小時，作為處理組;對照組加入等量TIL培養(yǎng)上清液處理相同時間。采用流式細(xì)胞技術(shù)，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測自體腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
　　 7.自體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

13、上清液中分子標(biāo)志物的檢測
　　 使用經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化后的TIL處理自體腫瘤細(xì)胞，留取處理前、后細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法(EIISA)檢測上清液中腫瘤標(biāo)志物(CA-125、CA-153)、VEGF、MMP-9的含量。
　　 8.統(tǒng)計處理
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS13.0 for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。兩樣本采用配對樣本T檢驗(yàn)(Paired-Sam

14、ples T Test)及兩相關(guān)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)（2 Related Samples Test）進(jìn)行分析。多重比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA)。P＜0.05（雙側(cè)）表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.TIL免疫表型的變化
　　 TIL經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增第14天與第0天相比較，CD3+由48.2±14.5％增加至69.6±10.7％(P＜0.01)，CD8+由21.7±11.9％增

15、加至37.0±10.5％(P＜0.01)，CD4+由20.4±16.7％增加至25.6±16.0％(P＜0.05)。CD4+/CD8+由1.5±1.7下降至0.8±0.8，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.TIL對自體腫瘤細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞的殺傷力
　　 初分離時（第0天），TIL對自體腫瘤細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞的殺傷力均不足7％，屬較低水平。隨培養(yǎng)時間延長，TIL對三種腫瘤細(xì)胞的殺傷力均有不同程度增

16、高。以對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷力增高最為明顯，由5.0±1.8％（第0天）增加至57.8±10.4％（第14天）(P＜0.01)。
　　 TIL對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷力，第7天高于第0天、第3天，第14天高于第0天、第3天、第7天，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 在培養(yǎng)第0天、第3天，TIL對三種細(xì)胞的殺傷力無顯著差異。第14天，TIL對自體腫瘤細(xì)胞的殺傷力（57.8±10.4％）高于K562細(xì)胞（32.5±1

17、7.5％）、Raji細(xì)胞（27.1±11.1％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.TIL對自體腫瘤細(xì)胞的致凋亡作用
　　 按照50∶1比例，應(yīng)用經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增第14天的TIL作為效應(yīng)細(xì)胞，處理自體腫瘤細(xì)胞（靶細(xì)胞）24小時。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果示，處理組凋亡率明顯高于對照組，分別為11.4±3.5％、1.3±0.6％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.腫瘤標(biāo)志物、VEGF、MMP

18、-9的變化
　　 經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增第14天的TIL處理后，卵巢癌自體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CA-125、CA-153、VEGF、MMP-9含量均有不同程度降低。CA-125由1051.4±583.8 U/ml降低至240.2±195.7U/ml，CA-153由115.1±48.9 pg/ml降低至93.1±50.9 pg/ml，VEGF由1480.0±520.0 pg/ml降低至697.6±273.7pg/ml，MMP-9由

19、1732.1±560.8 pg/ml降低至865.7±435.9 pg/ml。其中CA-125、VEGF、MMP-9差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，CA-153差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 卵巢癌TIL可體外分離、培養(yǎng)。經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化擴(kuò)增后，TIL表現(xiàn)出對自體腫瘤細(xì)胞良好的細(xì)胞毒活性，并具有一定的靶細(xì)胞特異性。經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化后的TIL可誘導(dǎo)自體腫瘤細(xì)胞凋亡。經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化的TIL處理后，卵巢癌自體