寡克隆肝癌浸潤淋巴細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性及機(jī)制研究.pdf

1、[研究目的]
　　 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltration lymphocyte，TIL)是一群存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群，具有特異、高效的抗腫瘤作用，是過繼免疫治療(adoptivecellular immunotherapy，ACI)的一種主要效應(yīng)細(xì)胞。然而，雖然現(xiàn)有的制備方法能得到大量TIL，但經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增的TIL抗瘤活性較低，臨床療效并不理想。研究表明，常規(guī)方法提取的TIL含有一定數(shù)量的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

2、(regulation T cell，Treg)，對(duì)于TIL的抗腫瘤活性具有抑制作用，并且TIL某些亞群分泌的TGF-β、IL-10能刺激Treg擴(kuò)增而導(dǎo)致TIL抗瘤活性低下，是TIL應(yīng)用于腫瘤治療陷入困境的一個(gè)重要原因。因此，如何獲得大量具有高抗瘤活性的TIL是過繼免疫治療的一個(gè)關(guān)鍵問題。本課題旨在建立一種寡克隆肝癌TIL培養(yǎng)方法，選擇性擴(kuò)增Treg含量少、抗瘤活性強(qiáng)的TIL細(xì)胞群，通過體外實(shí)驗(yàn)，了解TIL抗瘤活性與各種細(xì)胞因子之間的

3、關(guān)系，通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究寡克隆TIL的抗肝癌作用，從而為寡克隆肝癌TIL的過繼免疫治療提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [研究內(nèi)容與方法]
　　 1、H22肝癌荷瘤小鼠模型的建立
　　 收集對(duì)數(shù)生長期小鼠H22肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，取0.2 mL（包含約5×106個(gè)肝癌細(xì)胞），接種于雄性BALB/C小鼠前肢腋窩皮下，待腫瘤生長至直徑約1.0 cm時(shí)，處死小鼠，取腫瘤用于肝癌TIL分離和培養(yǎng)。
　　 2

4、、肝癌TIL分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 寡克隆TIL培養(yǎng)法:在新鮮分離腫瘤后，在不同部位取多個(gè)大小約2.0 mm3的腫瘤組織塊，取材范圍包括腫瘤中心至腫瘤交界區(qū)域(距腫瘤邊緣內(nèi)2mm)。將組織塊置于24孔板中，加入特定培養(yǎng)基，5％CO2條件下37℃恒溫培養(yǎng)。
　　 常規(guī)TIL培養(yǎng)法:取新鮮腫瘤組織標(biāo)本，取材范圍包括腫瘤中心至腫瘤交界區(qū)域(距腫瘤邊緣內(nèi)2mm)。多種酶消化、鋼網(wǎng)過濾、淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，用0.2％臺(tái)

5、盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，之后進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。
　　 3、過繼免疫治療實(shí)驗(yàn)
　　 選取腫瘤直徑1.0 cm左右的BALB/C異位移植瘤小鼠18只，隨機(jī)分為對(duì)照組、常規(guī)TIL治療組、寡克隆TIL治療組，每組6只。通過尾靜脈注射分別給予PBS液、常規(guī)培養(yǎng)的TIL和寡克隆培養(yǎng)的TIL后，監(jiān)測小鼠生長、腫瘤體積變化。治療30 d后處死，收集外周血和腫瘤組織，測量瘤重，檢測外周血細(xì)胞因子TGF-β、IL-10和IFN-γ含量，觀察腫瘤組織

6、病理變化以及腫瘤組織內(nèi)FoxP3和IL-17表達(dá)情況，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 4、主要檢測方法
　　 (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測TIL純度
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測TIL中CD8+T細(xì)胞比例，鑒定TIL純度。
　　 (2)MTT法分析TIL體外細(xì)胞毒性
　　 采用四甲基唑藍(lán)(MTT)方法，以TIL為效應(yīng)細(xì)胞，小鼠H22肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，效靶比例10∶1

7、，分析TIL對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性。
　　 (3)ELISA法測定外周血細(xì)胞因子含量
　　 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法，檢測外周血細(xì)胞因子TGF-β、IL-10和IFN-γ含量。
　　 (4)H&E染色和免疫組化法檢測腫瘤組織內(nèi)TIL及細(xì)胞因子
　　 應(yīng)用H&E染色和免疫組化法檢測腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤程度以及FoxP3和IL-17的表達(dá)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]

8、
　　 1、建立H22肝癌荷瘤小鼠模型
　　 BALB/C小鼠皮下注射H22肝癌細(xì)胞3～4 d后，可見皮下有腫塊形成，并且隨時(shí)間延長而不斷增大，2w時(shí)用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑約1.0 cm。
　　 2、寡克隆肝癌TIL的分離培養(yǎng)及鑒定
　　 寡克隆培養(yǎng)3～4h后，可見有少量淋巴細(xì)胞游走出腫瘤組織塊，24 h后在組織塊周圍可見密集的淋巴細(xì)胞群。隨著時(shí)間延長細(xì)胞數(shù)目不斷增加，2 w后數(shù)量可達(dá)到1.2×106/m

9、L。分別收集寡克隆培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的TIL，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的比例，寡克隆TIL培養(yǎng)法獲得的CD8+T細(xì)胞數(shù)(71.25±9.09)％遠(yuǎn)高于常規(guī)TIL培養(yǎng)法(41.89±5.57)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3、TIL對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞的體外殺傷活性
　　 MTT法分析TIL體外細(xì)胞毒性的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)2w后，寡克隆TIL和常規(guī)TIL對(duì)H22肝癌細(xì)胞均有殺傷作用，殺傷率分別是(72.56

10、±6.69)％和(46.24±4.03)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4、TIL對(duì)小鼠肝癌移植瘤的抑制作用
　　 治療后30 d，常規(guī)TIL治療組與寡克隆TIL治療組的腫瘤體積分別為(1.172±0.085) cm3和(0.891±0.061) cm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);瘤重分別為(1.31±0.22)g和(0.91±0.09)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);均低于對(duì)照組腫瘤體積(1

11、.714±0.040) cm3和瘤重(2.43±0.17)g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。寡克隆TIL治療組抑瘤率(62.52±3.76)％明顯高于常規(guī)TIL治療組(46.13±9.21)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 5、TIL治療后外周血細(xì)胞因子含量變化
　　 外周血細(xì)胞因子含量檢測結(jié)果顯示，治療后30d，常規(guī)TIL治療組和寡克隆TIL治療組外周血TGF-β含量分別為(241.44±56.01)

12、pg/mL和(65.73±44.79) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);IL-10含量分別為(166.52±59.20) pg/mL和(36.66±18.63) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);均低于對(duì)照組(388.21±18.67)pg/mL和(290.74±65.90) pg/mL，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。常規(guī)TIL治療組和寡克隆TIL治療組外周血IFN-γ含量分別為(538.57±103.

13、43) pg/mL和(876.32±114.52) pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);均高于對(duì)照組(106.66±12.93) pg/mL，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 6、TIL治療后瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤及細(xì)胞因子表達(dá)變化
　　 H&E病理染色結(jié)果顯示，TIL治療后30 d，腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤陽性率及中～強(qiáng)陽性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);常規(guī)TIL治療組與寡克隆TIL治

14、療組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.330)。
　　 免疫組化法檢測結(jié)果顯示，TIL治療后30d，腫瘤組織內(nèi)FoxP3和IL-17陽性率及中～強(qiáng)陽性率均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);常規(guī)TIL治療組腫瘤組織內(nèi)FoxP3陽性率及中～強(qiáng)陽性率均高于寡克隆TIL治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);常規(guī)TIL治療組腫瘤組織內(nèi)IL-17陽性率及中～強(qiáng)陽性率與寡克隆TIL治療組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.682)