雞淋巴細(xì)胞趨化因子基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、根據(jù)已報(bào)道的雞淋巴細(xì)胞趨化因子(ChLptn)的cDNA序列中的開放閱讀框架序列設(shè)計(jì)特異性引物，以科寶雞的脾臟脾淋巴細(xì)胞的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收，與克隆載體pGEM-Teasy連接后，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在含氨芐青霉素的LB平板上選擇培養(yǎng)后，挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。用此培養(yǎng)物作模板，進(jìn)行PCR鑒定。將PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化單菌落接種于LB(含AMP)培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后

2、抽提質(zhì)粒用EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，取陽性克隆進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物(ORF)全長294bp，其中第1-291位是該基因的閱讀框架(ORF)，由291bp組成，編碼97個(gè)氨基酸。經(jīng)DNAssistV1.02比對(duì)分析，所克隆基因與GenBank中收錄的雞ChLptn基因序列(cDNA)的同一性為99.66％，表明成功克隆獲得了雞淋巴細(xì)胞趨化因子基因的ORF。DNAssist分析表明，所克隆基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為11kDa，等

3、電點(diǎn)為10.9。 以克隆的cDNA序列中的ORF序列為基礎(chǔ)，分析pET-32a(+)的酶切圖譜，用PremierPrimer5.0設(shè)計(jì)引物，以E.coliDH5α(pGEM-T-easy-ChLptn)為模板克隆ChLptn的ORF，與質(zhì)粒載體pET-32a(+)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌E.coliBL21(DE3)，再進(jìn)行PCR和酶切鑒定及測序鑒定。將陽性轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示所表達(dá)融合蛋白

4、的分子量約為31kDa。在誘導(dǎo)1小時(shí)之后即開始大量表達(dá)，誘導(dǎo)4小時(shí)后表達(dá)量達(dá)最大。 以克隆的cDNA序列中的ORF序列和信號(hào)肽編碼區(qū)的ORF序列為基礎(chǔ)，分析pPIC9k的酶切圖譜，用PremierPrimer5.0設(shè)計(jì)引物，以E.coliDH5α(pGEM-T-easy-ChLptn)為模板克隆ChLptn(ORF-A)和ChLptn(ORF-B)，分別與載體質(zhì)粒pPIC9k連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌E.coliDH5α，再進(jìn)行

5、PCR和酶切鑒定及測序。將陽性轉(zhuǎn)化菌落用LB(含AMP)的液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用SacⅠ進(jìn)行線性化酶切后，電泳回收。制備畢赤酵母的感受態(tài)細(xì)胞，將線性化的pPIC9k-ChLptn(A)和pPIC9k-ChLptn(B)重組質(zhì)粒運(yùn)用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株GS115中。分別用MD和MM平板對(duì)轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒進(jìn)行表型篩選，最后選用在MD平板上生長正常但是在MM平板上沒有生長或者生長的不良的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，證實(shí)獲得了重組畢