培養(yǎng)淋巴細(xì)胞做過繼性免疫治療時細(xì)胞因子作用和基因表達(dá)特征.pdf

1、目的:在過繼免疫治療中需要加入不同的細(xì)胞因子,本研究分析不同細(xì)胞因子刺激后淋巴細(xì)胞分化方向和相關(guān)的基因表達(dá)特征。
　　 方法:采集正常人外周血淋巴細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞因子來自同一亞型的輔助淋巴細(xì)胞進(jìn)行組合,之后應(yīng)用不同組合的細(xì)胞因子分四組刺激外周血淋巴細(xì)胞,包括EBV多肽聯(lián)合多種細(xì)胞因子刺激組(簡稱EBV多肽組);誘導(dǎo)向TH1細(xì)胞分化的IL-12,IFN-γ,IL-2,抗CD3單抗組(簡稱加IL-12等組),誘導(dǎo)TH2的IL-4,IL

2、-5,IL-10,IL-13,IL-2,抗CD3單抗組(簡稱加IL-4等組),誘導(dǎo)分化為CTL細(xì)胞的GM-CSF,IL-15,IL-2,抗CD3單抗組(簡稱加GM-CSF等組),每組2管,3天換液一次,換液同時補加入相應(yīng)量的細(xì)胞因子,培養(yǎng)的D0、1、3、7、10天,從各組的兩管抽取1ml,混在一起(約5×10^6 cells),用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測總T細(xì)胞(CD3+),(輔助T細(xì)胞)CD3+CD4+,(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)CD3+CD

3、8+,(記憶型T細(xì)胞)CD3+CD8+CD45RO+,(初始型T細(xì)胞)CD3+CD8+CD45RA+,(TH2輔助細(xì)胞)CD3+CD30+,(B細(xì)胞)CD19+,(NK細(xì)胞)CD56+,(初始調(diào)節(jié)T細(xì)胞)CD4+CD25+,(精確調(diào)節(jié)T細(xì)胞)CD4+CD25+FOXP3+在培養(yǎng)前后百分比的變化(EBV多肽聯(lián)合細(xì)胞因子刺激組只在D0,D10天檢測上述基因與抗體)。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測看家基因MAD1、PTEN和輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因T

4、-BET(TH1)、GATA3(TH2)、細(xì)胞因子IFN-γ(TH1)、IL-4(TH2)基因表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.EBV多肽刺激組細(xì)胞臨床治療有確切療效。培養(yǎng)的外周血細(xì)胞來自接受細(xì)胞過繼免疫治療的NK-T細(xì)胞淋巴瘤患者的母親,EBV多肽組細(xì)胞培養(yǎng)10天回輸給患者,三天后熱退,EBV拷貝數(shù)從6.7×10^6拷貝/ml降為0,淋巴結(jié)腫大消失,臨床治療有效。表明成功獲得殺傷EBV并抗腫瘤的特異性淋巴細(xì)胞。

5、　　 2.EBV多肽組CTL細(xì)胞成為優(yōu)勢細(xì)胞,調(diào)節(jié)T細(xì)胞明顯下降,看家基因MAD1,PTEN變化不大,輔助淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因T-BET,GATA3表達(dá)明顯增加。EBV多肽組培養(yǎng)10天后CD3+CD8+細(xì)胞增加較明顯(D021.54％→D1058.82％),其他實驗組如在加IL-4等組(D021.54％→D1031.99％)與加IL-15等組(D021.54％→D1036.14％)呈酌漸上升趨勢,在加IL-12等組從D7天開始有明顯增

6、加(D021.54％→D1042.4％),效果均不如在EBV多肽刺激組明顯。說明EBV抗原肽可以有效刺激特異性CTL細(xì)胞的分化,而加IL-4等組效果較差。MAD1基因表達(dá)量均較處理前表達(dá)量減少,約為培養(yǎng)前的0.18-0.5倍左右;PTEN基因在加IL-15等組培養(yǎng)到D10天時,約為D0天的1.80倍,在EBV多肽刺激組約為D0天的1.55倍,在其他兩組較培養(yǎng)前變化不明顯(加IL-4等組D10天為D0天的1.40倍,加IL-12組D10天

7、為D0天的1.22倍);說明多種細(xì)胞因子的刺激對其表達(dá)很可能沒有明顯的作用。T-BET基因在EBV多肽刺激組D10天為D0天的5.84倍,加IL-15等組(5.58倍)及加IL-12(4.6倍)等組均有明顯增加,而在加IL-4等組D10天為D0天的2.79倍,GATA3基因在不同細(xì)胞因子刺激組較前均有增加,加IL-15等組D10約為D0的8.48倍,EBV多肽刺激組D10天約為D0天的8.20倍,加IL-12等組D10約為D0的8.13

8、倍,加IL-4等組D10約為D0的7.27倍,提示細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞向TH1,TH2亞型方向分化,但細(xì)胞因子對該亞型之外的亞型細(xì)胞的分化也有刺激作用
　　 3.比較加入EBV多肽和不同細(xì)胞因子培養(yǎng)結(jié)果,EBV抗原肽可以更有效刺激CTL,生成,而IL4,IL5,IL10,IL13的TH2組作用較差。IFN-γ的表達(dá)量較細(xì)胞因子處理前變化較明顯,在加IL-15等組(D10約為D0的2712倍),加IL-12等組培養(yǎng)到D10天時

9、,約為D0天的2030倍,及加IL-4等組(406倍)從D7天開始較D0天有明顯變化,EBV多肽刺激組(D10約為D0的61倍)均明顯增加;證明用不同組合的細(xì)胞因子對IFN-γ的分泌均有明顯作用。
　　 另外 CD3+CD8+CD45RO+細(xì)胞在EBV多肽刺激后增加(D027.92％→D1056.24％),在加IL-12等組酌漸上升趨勢(D027.92％→D1051.35％),在其他兩組從D1到D7天,增長不明顯,在培養(yǎng)到D10

10、天分別較D0天增加6.78％(加IL-4等組)、19.57％(加GM-CSF等組);
　　 CD3+CD8+CD45RA+細(xì)胞在EBV多肽刺激組培養(yǎng)后增加(D023.38％→D1037.21％),在其余三組均呈酌漸上升趨勢,D10天較D0天分別增加15％(加IFN-γ等組)、19.63％(加IL-4等組)、32.31％(加IL-15等組),進(jìn)一步證明了細(xì)胞因子的多效性。
　　 結(jié)論:
　　 用EBV多肽聯(lián)合細(xì)胞因