初始T淋巴細(xì)胞在腫瘤過繼性免疫治療中的應(yīng)用研究.pdf

1、腫瘤性疾病嚴(yán)重威脅人類的生命健康，然而目前手術(shù)、化療、放療等臨床治療中所采用的傳統(tǒng)常規(guī)腫瘤治療方法均無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞完全徹底的殺滅，使得惡性腫瘤不可避免的出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而且由于常規(guī)化療藥物及放療均無(wú)法實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷，所以在治療殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也使得正常組織細(xì)胞受到損傷，甚至影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，存在較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，使得實(shí)際臨床治療過程中部分腫瘤患者因不良反應(yīng)嚴(yán)重?zé)o法耐受而被迫放棄治療，所以探尋新的腫瘤特異性的治療

2、手段成腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著生物科學(xué)的進(jìn)步，為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究提供了新的思路和途徑，生物治療的概念逐漸引入到人類多種重大疾病的治療過程中。腫瘤生物免疫治療采用過繼性細(xì)胞回輸作為其主要治療方法是目前惡性腫瘤治療領(lǐng)域公認(rèn)的新成就之一。是指在體外對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行激活、擴(kuò)增，而后再將活化的免疫細(xì)胞重新回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)，進(jìn)行腫瘤殺傷的一種治療方法。目前在臨床中主要是提取患者外周血中的T細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞在體外條件下分別應(yīng)用各種細(xì)胞因子進(jìn)行

3、誘導(dǎo)刺激，活化成熟后共同培養(yǎng)，從而產(chǎn)生具有腫瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，而后再分次對(duì)經(jīng)過放療或化療預(yù)處理的患者進(jìn)行過繼性回輸，在患者體內(nèi)產(chǎn)生具有靶向性的抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫殺傷療效。同時(shí)隨著相關(guān)研究的逐步增多，如何實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞高效、快速的體外篩選、擴(kuò)增，如何使T細(xì)胞能夠高度特異性地靶向識(shí)別腫瘤靶點(diǎn)，如何使T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間盡可能延長(zhǎng)以及如何能夠有效調(diào)控T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖情況等均成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。同時(shí)由于腫瘤微環(huán)境中存在復(fù)雜的免疫抑

4、制網(wǎng)絡(luò)，是困擾腫瘤免疫治療的關(guān)鍵，使得腫瘤免疫治療的實(shí)際效果受到了限制，總體療效并不令人滿意。早在1979年Lord等人就正式提出了腫瘤微環(huán)境的概念，腫瘤微環(huán)境即指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中所處的宿主機(jī)體的內(nèi)在環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞自身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、微淋巴管、局部浸潤(rùn)性細(xì)胞、各種細(xì)胞因子以及組織液等共同構(gòu)成。存在于腫瘤微環(huán)境中的各種免疫抑制性細(xì)胞及抑制性細(xì)胞因子造就了腫瘤病變局部的免疫抑制性微環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等方面發(fā)揮著重要

5、作用。所以通過特定手段對(duì)腫瘤患者體內(nèi)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行干預(yù)可以提高過繼性免疫治療的療效，應(yīng)用全身化療干擾腫瘤微環(huán)境是目前臨床上最常用的方法之一。
　　T細(xì)胞包括初始T細(xì)胞(naive T細(xì)胞)和記憶性T細(xì)胞(memoryT細(xì)胞)兩個(gè)重要功能亞群。初始T細(xì)胞(naive T cells)是指脫離胸腺組織后還未受到過抗原刺激的T細(xì)胞，是T細(xì)胞的重要功能亞群，對(duì)于機(jī)體針對(duì)新抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答非常重要，在機(jī)體內(nèi)通過在血液與次級(jí)淋巴器官間的再循環(huán)

6、執(zhí)行著免疫監(jiān)視功能，受到抗原刺激的時(shí)候，樹突狀細(xì)胞(DC)攝取抗原物質(zhì)加工后在淋巴結(jié)中遞呈給初始T細(xì)胞，初始T細(xì)胞能發(fā)生活化及增殖，分化成為具有靶向殺傷能力的效應(yīng)性T細(xì)胞來(lái)發(fā)揮作用，當(dāng)初始T細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分化成為效應(yīng)性T細(xì)胞后，其功能以及游走性質(zhì)均發(fā)生變化，且活化的效應(yīng)性T細(xì)胞具有極強(qiáng)的增殖活性，幾天內(nèi)可以擴(kuò)增達(dá)1000倍以上。隨著研究的不斷深入，其在過繼性免疫治療中的應(yīng)用價(jià)值逐漸得到了人們的重視。所以本研究設(shè)計(jì)了第一部分實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用B16腫

7、瘤細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠造模，通過流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)不同荷瘤時(shí)長(zhǎng)的小鼠外周血初始T淋巴細(xì)胞數(shù)量水平的動(dòng)態(tài)變化情況，了解初始T細(xì)胞水平與小鼠荷瘤后機(jī)體免疫狀態(tài)的關(guān)系，為制定個(gè)體化免疫治療方案完善相關(guān)數(shù)據(jù)。并進(jìn)一步設(shè)計(jì)第二部分體外實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用磁珠陰性分選的方法分離提取C57BL/6小鼠脾細(xì)胞懸液中的初始T細(xì)胞及總T細(xì)胞，在體外條件下了解初始T細(xì)胞的功能特性。最終在應(yīng)用環(huán)磷酰胺干擾小鼠腫瘤微環(huán)境的基礎(chǔ)上進(jìn)行第三部分實(shí)驗(yàn)，對(duì)荷瘤的C57B

8、L/6小鼠分別給予初始T細(xì)胞來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞(TEFFN)及總T細(xì)胞來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞(TEFFP)回輸治療，進(jìn)一步對(duì)比觀察在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中初始T細(xì)胞來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞的療效。
　　第一部分、不同荷瘤時(shí)長(zhǎng)的小鼠外周血初始T淋巴細(xì)胞水平變化情況的研究
　　目的:通過流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)不同荷瘤時(shí)長(zhǎng)的小鼠外周血初始T淋巴細(xì)胞數(shù)量水平的動(dòng)態(tài)變化情況，了解初始T細(xì)胞水平與小鼠荷瘤后機(jī)體免疫狀態(tài)的關(guān)系，為制定個(gè)體化免疫治療方案完善相關(guān)數(shù)據(jù)。<

9、br>　　方法:應(yīng)用C57BL/6小鼠通過背部皮下接種B16腫瘤細(xì)胞株制備惡性黑色素瘤的小鼠荷瘤模型;造模成功后定期處死小鼠取脾制備脾淋巴細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)其中初始T淋巴細(xì)胞的數(shù)量水平，并設(shè)定正常不荷瘤小鼠為空白對(duì)照組。
　　結(jié)果:
　　1.將B16黑色素瘤細(xì)胞株接種于C57BL/6小鼠背部皮下，10天后局部可見直徑約2-3mm的腫瘤略突出于皮面，顏色呈黑色，提示小鼠荷瘤模型成功建立。
　　2.荷瘤組及

10、對(duì)照組小鼠隨周齡的增加及荷瘤時(shí)間的延長(zhǎng)其外周血中初始T細(xì)胞水平均會(huì)出現(xiàn)下降表現(xiàn)，但荷瘤組下降幅度更為顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論:隨著小鼠荷瘤時(shí)間延長(zhǎng)荷瘤負(fù)擔(dān)的增加，其外周血初始T細(xì)胞含量出現(xiàn)進(jìn)行性下降，提示初始T細(xì)胞水平與小鼠荷瘤后機(jī)體免疫狀態(tài)有著密切的關(guān)系。
　　第二部分、初始T細(xì)胞的分離提取及體外功能檢測(cè)
　　目的:了解初始T細(xì)胞在體外環(huán)境中的功能特性。
　　方法:應(yīng)用磁珠陰性分選方法由小鼠脾淋巴細(xì)胞懸

11、液中分選得出總T細(xì)胞，并流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)了解總T細(xì)胞中初始CD8+T細(xì)胞及初始CD4+T細(xì)胞的比例，由小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中分選得出初始CD8+T細(xì)胞和初始CD4+T細(xì)胞依照比例混合得到初始T細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)比體外條件下，初始T細(xì)胞及總T細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞因子分泌能力以及不同細(xì)胞來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞的殺傷能力。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)磁珠陰性分選得到富集的CD3+T、初始CD8+T及初始CD4+T細(xì)胞，流式檢測(cè)鑒定其純度，分

12、選后CD3+T細(xì)胞純度達(dá)90.4±1.3％、分選后初始CD8+T細(xì)胞純度達(dá)88.6±0.5％、分選后初始CD4+T細(xì)胞純度達(dá)82.2±0.9％，細(xì)胞純度能夠滿足實(shí)施進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。
　　2.經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)總CD3+T細(xì)胞中初始CD4+T細(xì)胞與初始CD8+T細(xì)胞比值為（1.9±0.1）∶1，故選擇初始CD4+T細(xì)胞∶初始CD8+T細(xì)胞=2∶1的比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，將混合培養(yǎng)的初始T細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.分別對(duì)總T細(xì)胞組

13、及初始T細(xì)胞組給予兩次刺激，應(yīng)用CCK-8染色、酶標(biāo)儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)孔OD值提示經(jīng)第一次刺激后總T細(xì)胞及初始T細(xì)胞均較刺激前有增殖，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但總T細(xì)胞與初始T細(xì)胞增殖水平間無(wú)明顯差異(P＞0.05);而在給予第二次刺激后與第一次刺激后比較，總T細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異(P＞0.05)，初始T細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)第二次刺激后初始T細(xì)胞增殖水平較總T細(xì)胞者增高(P＜0.05)4.將腫瘤細(xì)

14、胞與CTL共培養(yǎng)后初期可見到CTL細(xì)胞聚集于B16細(xì)胞表面，隨時(shí)間延長(zhǎng)后可見到B16腫瘤細(xì)胞縮小、細(xì)胞皺縮變形、破碎裂解壞死。結(jié)果示殺傷反應(yīng)后TEFFP+B16組及TEEFN+B16組B16細(xì)胞數(shù)量較單一B16組均減少(P＜0.05)，同時(shí)TEFFN+B16組B16細(xì)胞數(shù)量少于TEFFP+B16組(P＜0.05)。5.經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各不同反應(yīng)階段上清液中IL-2及IFN-r水平，在T細(xì)胞與TL-DC首次接觸活化CTL后上清液中IL-2及I

15、FN-r水平總T細(xì)胞組均較初始T細(xì)胞組增高(P＜0.05)，而在體外殺傷實(shí)驗(yàn)中所得上清液中IL-2及IFN-r水平，總T細(xì)胞組較殺傷反應(yīng)前降低(P＜0.05)，而初始T細(xì)胞組較殺傷反應(yīng)前升高，且明顯高于總T細(xì)胞組(＜0.05)。
　　結(jié)論:在體外條件下初始T細(xì)胞較總T細(xì)胞有著更強(qiáng)的增殖能力、細(xì)胞因子釋放能力及效應(yīng)細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷能力。
　　第三部分、初始T細(xì)胞來(lái)源的CTL回輸治療效果觀察
　　目的:了解初始T細(xì)胞來(lái)源的

16、效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中的功能特性。
　　方法:依照第二部分實(shí)驗(yàn)方法分選T細(xì)胞，得到總T細(xì)胞及初始T細(xì)胞;應(yīng)用C57BL/6小鼠通過背部皮下接種B16腫瘤細(xì)胞株制備惡性黑色素瘤的小鼠荷瘤模型;應(yīng)用環(huán)磷酰胺腹腔注射干擾荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境;于環(huán)磷酰胺預(yù)處理后第4天，將分別1×106的TEFFP或TEFFN，經(jīng)鼠尾靜脈注射回輸入成功荷瘤的小鼠體內(nèi)進(jìn)行過繼性免疫治療，并設(shè)對(duì)照組給予回輸?shù)润w積PBS，于回輸后72小時(shí)處死部分小鼠取腫瘤組織，CF

17、SE標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞組應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度，無(wú)熒光標(biāo)記組腫瘤標(biāo)本應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)Perfoin mRNA、granzymemRNA、IL-2 mRNA及IFN-rmRNA表達(dá)水平，剩余小鼠用于觀察對(duì)比不同來(lái)源DC-CTL過繼治療對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，每2天測(cè)量腫瘤體積繪制荷瘤變化曲線。
　　結(jié)果:
　　1.腹腔注射CTX可以有效降低荷瘤小鼠外周血CD4+ CD25+ Foxp3+T細(xì)胞水平(

18、P＜0.05)、血清TGF-β水平(P＜0.05)以及血清IL-10水平（P＜0.05），其腹腔注射CTX對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)未見明顯影響。
　　2.CFSE染色的DC-CTL細(xì)胞回輸小鼠腫瘤組織制冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察檢測(cè)熒光強(qiáng)度提示，在腫瘤組織中均可檢測(cè)到熒光染色細(xì)胞的存在，且TEFFN組較TEFFP組熒光強(qiáng)度高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)Perfoin mRNA、granzy

19、me mRNA、IL-2 mRNA及IFN-rmRNA表達(dá)情況，TEFFN組各指標(biāo)表達(dá)情況均高于TEFFP組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。4.不同細(xì)胞來(lái)源的成熟DC-CTL過繼治療對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響觀察顯示，空白對(duì)照組小鼠腫瘤增長(zhǎng)明顯，給予DC-CTL治療后，小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而TEFFN組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度較TEFFP組為低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)結(jié)論:初始T細(xì)胞來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞可以表現(xiàn)出更