調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能穩(wěn)定性及其在免疫治療中的作用機(jī)制研究.pdf

1、CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在維持機(jī)體免疫平衡中起著重要作用，而Foxp3在Treg的表達(dá)水平與Treg的功能直接相關(guān)?；A(chǔ)與臨床的多項(xiàng)研究已證實(shí)Tregs能夠治療多種疾病，包括自身免疫性糖尿病，實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎等。目前，如何培養(yǎng)穩(wěn)定，有效的Tregs功能是其研究的熱點(diǎn)。有研究小組發(fā)現(xiàn)Tregs在炎癥環(huán)境下不穩(wěn)定，容易失去Foxp3表達(dá)，同時(shí)失去Foxp3的前Tregs表達(dá)大量的IL-17，從而加重疾病反應(yīng)。因此

2、，本課題旨在分析和探究能夠獲得穩(wěn)定Tregs的最佳方案。并檢測(cè)與Tregs穩(wěn)定性關(guān)系重大的相關(guān)標(biāo)志物及其相關(guān)的信號(hào)通路。本課題的成功對(duì)Tregs臨床治療具有一定的普遍意義并為移植術(shù)后免疫耐受的誘導(dǎo)提供新的思路。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 TGF-β誘導(dǎo)的CD4+Foxp3+iTregs在急性移植物抗宿主病中的作用和機(jī)制研究。
　　誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(induced regulatoryT cel

3、ls，iTregs)被認(rèn)為可以用來(lái)治療自身免疫性疾病。然而最新研究發(fā)現(xiàn)其在急性移植物抗宿主病模型中療效不明顯，其原因在于iTregs功能不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易轉(zhuǎn)化為其他細(xì)胞，從而失去免疫抑制功能。本文旨在探討iTregs在急性移植物抗宿主病中功能及穩(wěn)定性的影響。
　　目的:通過(guò)研究iTregs在急性移植物抗宿主病模型中的作用，鑒別不同iTregs培養(yǎng)方案對(duì)其細(xì)胞功能的影響。
　　方法:運(yùn)用TGF-β，IL-2誘導(dǎo)iTregs治療

4、兩種不同的小鼠急性移植物抗宿主病模型。在一些實(shí)驗(yàn)中CFSE標(biāo)記的Tregs被注入小鼠體內(nèi)來(lái)監(jiān)測(cè)Tregs體內(nèi)的穩(wěn)定性?？笴D25抗體被用來(lái)拮抗Tregs，觀測(cè)拮抗Tregs后，移植物抗宿主病模型的生存率。最后，還監(jiān)測(cè)了不同方案的iTregs的體外與體內(nèi)穩(wěn)定性和功能。
　　結(jié)果:iTregs具有較強(qiáng)的保護(hù)急性移植物抗宿主病的功能，這種保護(hù)作用是通過(guò)iTregs抑制供者CD4細(xì)胞，CD8細(xì)胞的擴(kuò)增以及供者CD8細(xì)胞的殺傷作用，保護(hù)受者

5、B細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，觀測(cè)到iTregs能夠保持穩(wěn)定并持續(xù)發(fā)揮功能，最后的研究還發(fā)現(xiàn)anti-CD3/CD28磁珠誘導(dǎo)的iTregs比anti-CD3包板誘導(dǎo)的iTregs具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　結(jié)論:只有運(yùn)用正確的誘導(dǎo)擴(kuò)增方案，才能夠培養(yǎng)出狀態(tài)穩(wěn)定，具有強(qiáng)大抑制功能的iTregs，從而保護(hù)急性移植物抗宿主病。
　　第二部分 全反式維甲酸對(duì)肝臟移植術(shù)后患者iTregs的作用研究
　　目的:通過(guò)全反式維甲酸

6、作用肝臟移植術(shù)后患者iTregs，分析全反式維甲酸對(duì)iTregs功能的影響。
　　方法:運(yùn)用TGF-β，IL-2與全反式維甲酸從肝臟移植術(shù)后患者提取的幼稚T細(xì)胞中的誘導(dǎo)iTregs，檢測(cè)Foxp3表達(dá)，體外擴(kuò)增功能。通過(guò)CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞與iTregs共培養(yǎng)，觀察全反式維甲酸作用的iTregs的體外抑制功能。同時(shí)，建立小鼠異種移植物抗宿主病模型，并由尾靜脈回輸iTregs觀察iTregs對(duì)異種移植物抗宿主病的保護(hù)作用以及相關(guān)細(xì)胞

7、因子表達(dá)情況。
　　結(jié)果與結(jié)論:全反式維甲酸能夠增強(qiáng)患者iTregsFoxp3的表達(dá)以及擴(kuò)增倍數(shù)，同時(shí)提高iTregs的體內(nèi)與體外功能。本研究為iTregs在臨床治療的實(shí)際問(wèn)題提供了新的解決方案。
　　第三部分 人CD39hi nTreg亞群的穩(wěn)定性和功能研究及其相關(guān)機(jī)制分析
　　自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells，nTregs)被認(rèn)為可以用來(lái)治療自身免疫性疾病。然而研究表明其在炎癥

8、環(huán)境下易轉(zhuǎn)化為T(mén)h1，Th17細(xì)胞，從而失去免疫抑制功能，CD39是與Tregs功能相關(guān)的表面標(biāo)志，可能與Tregs的穩(wěn)定性有關(guān)。
　　目的:通過(guò)研究CD39hi nTregs與CD39low nTregs在炎癥環(huán)境下的表型和穩(wěn)定性差異，為臨床運(yùn)用具有功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:分選出人CD4+CD25brightnTreg并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增7天，流式分選出CD39hi nTreg和CD39low

9、nTreg加入IL-1β或者IL-6繼續(xù)培養(yǎng)1至3天，將獲得的nTregs進(jìn)行體內(nèi)外抑制功能檢測(cè)，利用免疫印跡法檢測(cè)STAT1，p-STAT1，STAT3，p-STAT3的表達(dá)水平，并分析Foxp3啟動(dòng)子區(qū)域的變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用不同類(lèi)型nTregs回輸異種移植物抗宿主疾病。
　　結(jié)果:CD39hi nTregs比CD39low nTregs具有更加強(qiáng)大的免疫抑制功能，在體外實(shí)驗(yàn)中，CD39hi nTregs能夠保持Foxp3表達(dá)，

10、具有較強(qiáng)的抑制T細(xì)胞擴(kuò)增的能力;而CD39low nTregs快速丟失Foxp3表達(dá)，并轉(zhuǎn)化為T(mén)h1，Th17細(xì)胞。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CD39hi nTregs能夠保護(hù)異種移植物抗宿主病的體重變化，提高生存率。最后，IL-2能夠顯著提高CD39low nTregs的體內(nèi)功能和穩(wěn)定性，這種作用與STAT1，STAT3磷酸化和DNA甲基化水平有關(guān)。
　　結(jié)論:nTregs的穩(wěn)定性與CD39表達(dá)有關(guān)，Tregs體外擴(kuò)增后分選CD39hinT