調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡在膿毒癥免疫抑制中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 嚴(yán)重膿毒癥導(dǎo)致的多器官功能障礙仍然是臨床上嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷患者的主要死亡原因，深入理解膿毒癥患者發(fā)病過程中的病理生理機(jī)制是尋找膿毒癥有效治療策略的關(guān)鍵手段。有資料證實(shí)，膿毒癥后期免疫功能紊亂是臨床膿毒癥患者死亡的關(guān)鍵誘因之一，其免疫功能障礙包括輔助性T細(xì)胞(Th)1型反應(yīng)向Th2型反應(yīng)“漂移”、巨噬細(xì)胞表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ(MHC)及共刺激分子表達(dá)的喪失、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的大量凋亡等，而淋巴細(xì)胞

2、的過度凋亡在其中占有重要地位。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是一類具有免疫負(fù)調(diào)控功能的成熟T細(xì)胞亞群，對免疫耐受和免疫平衡的維持發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在膿毒癥免疫功能紊亂中的作用也受到了越來越多的關(guān)注。Treg表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性兩大特性，主要通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制和細(xì)胞因子分泌的方式發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。膿毒癥發(fā)病的過程中，Treg發(fā)揮著一個(gè)關(guān)鍵“調(diào)控點(diǎn)”的作用，通過誘導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞(Tef

3、f)的凋亡、下調(diào)樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)、抑制CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞功能、介導(dǎo)Th1向Th2反應(yīng)的漂移等不同的機(jī)制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。
　　 Treg誘導(dǎo)Teff凋亡的機(jī)制研究已有多篇報(bào)道，可能包括抑制CD4+CD25-Teff細(xì)胞白細(xì)胞介素(IL)-2 mRNA的表達(dá)、競爭性消耗IL-2(細(xì)胞因子剝奪的方式)以誘導(dǎo)CD4+CD25-Teff的凋亡、通過Fas配體(FasL)/Fas途徑誘導(dǎo)CD4+CD25-Teff細(xì)胞

4、凋亡、經(jīng)由顆粒酶依賴機(jī)制促進(jìn)CD4+CD25-Teff的凋亡等，但其確切分子調(diào)控機(jī)制并不清楚，尚待進(jìn)一步探討。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)是Treg分泌的一種多功能免疫效應(yīng)因子，包括可溶性及膜結(jié)合型(TGFβ1m+)。有資料證實(shí)，Treg能夠通過TGFβ1m+以接觸依賴的方式抑制CD4+CD25-Teff增殖，我們推測，TGFβ1m+可能參與了Treg介導(dǎo)Teff凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

5、。
　　 TGFβ1的信號主要通過其下游的Smad分子傳遞，在TGFβ信號通路中，活化的TGFβ1首先結(jié)合Ⅱ型TGFβ受體(TβRⅡ)，隨后與Ⅰ型TGFβ受體(TβRⅠ)二聚體形成活化的信號復(fù)合物，TβRⅡ激酶區(qū)引起TβRⅠ-GS結(jié)構(gòu)域磷酸化并活化?；罨腡βRⅠ與胞漿內(nèi)以同源寡聚體存在的Smad2/3分子短暫結(jié)合，使Smad2/3分子C端的SSxS基序中兩個(gè)絲氨酸殘基磷酸化而激活，并與Smad4結(jié)合形成異源六聚體進(jìn)入胞核，作為

6、轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)或與其他DNA結(jié)合蛋白共同激活特定靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 Bcl-2家族蛋白是一組與線蟲抗凋亡基因CED-9同源的蛋白質(zhì)，對T淋巴細(xì)胞的凋亡具有精細(xì)調(diào)控作用。Bcl-2家族分為促凋亡成員(Bax、Bak、Bim、Bmf、Bad、Bid)和抗凋亡成員(Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL、Mcl-1、Bfl-1/A1)。正常情況下，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白結(jié)合處于失活狀態(tài)，在凋亡信號的刺激下，作為凋亡感受器的Bim蛋白感受

7、到凋亡信號的刺激后釋放作為凋亡執(zhí)行者的Bax、Bak蛋白，Bax、Bak蛋白則結(jié)合到線粒體外膜上，促進(jìn)線粒體外膜通透性增高，即線粒體外膜上的巨型通道開放，導(dǎo)致線粒體外膜的透化作用(MOMP)、膜兩面的離子分布失衡，膜電位下降、細(xì)胞色素C釋放、胱天蛋白酶(caspase)9激活，造成細(xì)胞凋亡。
　　 Caspase家族成員是一組與凋亡密切相關(guān)的蛋白酶，在凋亡的調(diào)節(jié)中起著核心作用。caspase的活化包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑，外源

8、性途徑由死亡受體信號(TNF-受體家族)始動(dòng)，通過形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)介導(dǎo)caspase8的激活;內(nèi)源性途徑由應(yīng)激信號(如TGFβ)始動(dòng)，受到Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡蛋白的調(diào)節(jié)，通過細(xì)胞色素C的釋放激活caspase9。最終活化的caspase8、caspase9都通過激活下游的caspase3介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。鑒于此，我們擬觀察膿毒癥狀態(tài)下小鼠脾臟Treg的表型及比例的變化以及CD4+CD25-Teff中凋亡信號通路

9、的活化情況，初步探討Treg通過TGFβ1m+促進(jìn)CD4+CD25-Teff的凋亡的分子機(jī)制，旨在從新的角度探尋調(diào)控膿毒癥中Teff過度凋亡的新靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.模型制備及實(shí)驗(yàn)分組:應(yīng)用SPF級健康雄性BALB/c小鼠復(fù)制盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)造成膿毒癥模型。小鼠隨機(jī)分為正常對照組、假傷組(sham組)、CLP組、CLP+PC61組、CLP+HRPN組，其中PC61為Treg的特異性抑制劑，HRPN為P

10、C61的同型對照蛋白IgG。上述各組中每組動(dòng)物各20只，CLP+PC61組、CLP+HRPN組先于CLP術(shù)前5天腹腔注射PC61及HRPN后再建立膿毒癥小鼠模型。Sham組只游離盲腸，不行盲腸結(jié)扎和穿孔術(shù)。
　　 2.各組小鼠CLP術(shù)后24 h眼球取血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測外周血中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、干擾素(IFN)-γ、TGFβ含量變化。
　　 3.采用免疫磁珠法分離純化小鼠脾臟C

11、D4+CD25+Treg細(xì)胞及CD4+CD25-Teff細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)、叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子p3(Foxp3)、TGFβ1m+的表達(dá)以及CD25比例的變化，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測Treg中TGFβ1 mRNA的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠CD4+CD25-T的凋亡率，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行Treg TGFβ1m+表達(dá)率和Teff細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析

12、。
　　 4.采用Western blot檢測各組小鼠CD4+CD25-T內(nèi)Smad2/Smad3、磷酸化(P)-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2家族蛋白Bcl-2/Bim的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠CD4+CD25-T內(nèi)線粒體膜電位改變情況;共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞色素C的變化;化學(xué)比色法檢測各組小鼠CD4+CD25-Teff內(nèi)caspase3、caspase8、caspase9的活化情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

13、:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用(x)±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 主要結(jié)果:
　　 1.術(shù)后CLP組小鼠出現(xiàn)一系列符合膿毒癥癥狀的表現(xiàn)，死亡均發(fā)生在術(shù)后12h之后，72 h死亡率50％，初步建立了穩(wěn)定的膿毒癥小鼠模型;造模后24 h呈現(xiàn)細(xì)胞免疫功能障礙改變。
　　 2.術(shù)后24 h CLP組小鼠外周血中促炎細(xì)胞因子包括IL-2、IF

14、N-γ水平均較正常對照組和sham組顯著升高(P＜0.01)。CLP+PC61組IL-2、IFN-γ水平升高更加明顯，與CLP組比較存在明顯差異(P＜0.01)。抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGFβ在CLP組與正常對照組和sham組比較，僅IL-4水平呈明顯升高(P＜0.01)，而IL-10、TGFβ升高不明顯。CLP+PC61組IL-4、IL-10、TGFβ水平較CLP組呈現(xiàn)不同程度的下降(P＜0.05或P＜0.01)。

15、　　 3.小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過MACS兩次分選后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Treg純度可達(dá)到95％，CD4+CD25-Teff純度可達(dá)90％，所獲得的Treg和Teff細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)檢測活性均達(dá)95％以上。
　　 4.Treg的特異性表型Foxp3及CTLA-4的表達(dá)在正常對照組和sham組均無明顯差異，而在CLP組則明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。CLP+PC61組Foxp3及CTLA-4表達(dá)恢復(fù)至正常對照

16、組水平，與CLP組存在明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。TGFβ1m+水平在CLP組亦明顯升高，而PC61處理組則顯著下降，甚至低于正常對照組和sham組(P＜0.05)。CD25在CD4+T細(xì)胞中的比例變化趨勢與TGFβ1m+變化一致，在CLP+PC61組低于正常對照組和sham組(P＜0.05)。
　　 5.正常對照組和sham組TGFβ1 mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CLP組與正常對照組和sham組比較其表達(dá)量明顯增

17、強(qiáng)(P＜0.01)，而CLP+PC61組TGFβ1mRNA表達(dá)量顯著低于正常對照組、sham組和CLP組(P＜0.01)。
　　 6.各組Teff的凋亡率在CLP組最高，達(dá)23.98％，CLP+HRPN組凋亡率為21.74％，與CLP組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而CLP+PC61組Teff凋亡率與正常對照組和sham組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但明顯低于CLP組(P＜0.01)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞TGFβ1m+表達(dá)率與Te

18、ff細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.791，p=0.000)。
　　 7.各組CD4+CD25-Teff內(nèi)Smad2/Smad3表達(dá)均無明顯差異，CLP組P-smad2/P-Smad3表達(dá)量明顯高于正常對照組和sham組(P＜0.01)，CLP+PC61組P-smad2/P-Smad3表達(dá)與正常對照組和sham組無明顯差異，但顯著低于CLP組(P＜0.01)。CLP組CD4+CD25-Teff內(nèi)抗凋亡蛋白B

19、cl-2的表達(dá)與正常對照組和sham組比較明顯降低(P＜0.01)，促凋亡蛋白Bim的表達(dá)則顯著升高(P＜0.01)。而CLP+PC61組的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)與正常對照組和sham組比較亦明顯降低(P＜0.01)，但顯著高于CLP組(P＜0.01); CLP+PC61組促凋亡蛋白Bim的表達(dá)與正常對照組和sham組比較明顯升高(P＜0.01)，但仍然明顯低于CLP組(P＜0.01)。與正常對照組和sham組比較，CLP組CD4+

20、CD25-Teff內(nèi)線粒體膜電位顯著下降(P＜0.01)，PC61干預(yù)組與正常對照組、sham組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但明顯高于CLP組(P＜0.01)。細(xì)胞色素C的變化趨勢與線粒體膜電位相反，CLP組細(xì)胞色素C水平明顯高于正常對照組、sham組(P＜0.01)，而CLP+PC61組細(xì)胞色素C水平與對照組、sham組比較無顯著差異，但明顯低于CLP組。
　　 8.CLP組CD4+CD25-Teff中caspase3、caspase

21、8、caspase9活性較正常對照組和sham組均明顯升高(P＜0.01)，而給予PC61處理組CD4+CD25-Teff內(nèi)caspase3、caspase9活性與正常對照組和sham組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但顯著低于CLP組(P＜0.01);雖然caspase8活性明顯高于正常對照組和sham組，但仍低于CLP組(P＜0.01)。
　　 主要結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用CLP方法建立的膿毒癥小鼠模型穩(wěn)定、可靠，能夠滿足標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物

22、模型的要求，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 2.采用免疫磁珠法分離獲取小鼠脾臟Treg細(xì)胞，所得細(xì)胞純度高，細(xì)胞活力好，完全可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 3.膿毒癥小鼠脾臟Treg免疫抑制活性增強(qiáng)，促進(jìn)CD4+CD25-Teff發(fā)生凋亡，該作用可能為TGFβ1m+所介導(dǎo)。推測其大致過程為Treg上的TGFβ1m+通過與Teff上表達(dá)的TGFβ受體結(jié)合，激活下游的Smad2/Smad3信號分子，Smad2/Sm