調(diào)節(jié)性、效應(yīng)性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在膽道閉鎖患兒免疫炎癥發(fā)展中的作用.pdf

1、研究目的：研究CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、效應(yīng)性Th17細(xì)胞（Th17）、樹突狀細(xì)胞（DC）及Toll 樣受體（TLR）在膽道閉鎖（BA）患兒免疫炎癥發(fā)展中的作用；并通過小鼠模型，觀察通過注射IL-6中和抗體抑制Th17細(xì)胞分化對膽道閉鎖發(fā)病的影響。
　　 研究方法：收集32例膽道閉鎖和18例對照組患兒（非膽道疾?。└闻K和外周血標(biāo)本。實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR)及免疫組織化學(xué)方法檢測肝臟組

2、織Foxp3、IL-17、ROR-γt的mRNA 及蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例；ELISA 法檢測血清中相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β、IL-17、IL-6、IFN-γ、IL-12的表達(dá)；分離外周血樹突狀細(xì)胞（DC），CD4+T和CD8+T細(xì)胞，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6的表達(dá)變化；將T 淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞混合培養(yǎng)，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-1

3、7的表達(dá)；Q-RT-PCR，Western blot 及免疫熒光檢測DC細(xì)胞TLR3、7、8 mRNA 及蛋白的表達(dá)。應(yīng)用恒河猴輪狀病毒（RRV）建立膽道閉鎖小鼠模型，將新生Balb/c 鼠隨機(jī)分為正常對照組，病毒對照組和IL-6 抗體組，正常對照組腹腔注射病毒培養(yǎng)液，即含2％胎牛血清的最低必須培養(yǎng)基（2％FCS-MEM），病毒對照組腹腔注射RRV，IL-6 抗體組在腹腔注射RRV 之后的24 小時按注射劑量分4組注射IL-6中和抗體，

4、分別為5μg，15μg，20μg，25μg，觀察小鼠的臨床表現(xiàn)及其組織病理學(xué)變化。應(yīng)用實(shí)時定量熒光PCR（Q-RT-PCR）分別檢測正常對照組，病毒對照組，IL-6 抗體組小鼠出生4、7、10、14、21天肝臟Foxp3，IL-17，ROR-γt mRNA的表達(dá)；分離脾臟樹突狀細(xì)胞（DC），CD4+T和CD8+T細(xì)胞，ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6的表達(dá)變化；將T 淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞混合培養(yǎng)，ELISA 法檢測培養(yǎng)上清中IL-1

5、7的表達(dá)；Q-RT-PCR檢測DC細(xì)胞TLR3、7、8 mRNA的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：免疫組織化學(xué)顯示BA組肝組織匯管區(qū)Treg和Th17細(xì)胞明顯比對照組增多，肝臟Foxp3、ROR-γt，IL-17的mRNA 及蛋白表達(dá)量也顯著高于對照組患兒。BA組中血清TGF-β、IL-10（Treg 相關(guān)因子）、IL-17（Th17 相關(guān)因子)、IL-12、IFN-γ（Th1 相關(guān)因子)和IL-6 均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、其中IL-6升高24 倍，最為明顯。流式細(xì)胞學(xué)檢查顯示外周血Th17/CD4+T 比例顯著高于對照組；Treg/CD4+T細(xì)胞比例無差異；而同一患者中Treg/Th17 比例顯著低于對照組。體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)BA組DC細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-6 明顯增高；BA組PMBC+DC細(xì)胞+TGF-β培養(yǎng)上清中IL-17表達(dá)增高；DC細(xì)胞TLR3、7、8的表達(dá)顯著高于對照組。94只病毒對照組小鼠中64只小鼠發(fā)生BA（71.91％），出現(xiàn)發(fā)育遲緩（表現(xiàn)為

7、體重增加緩慢、停滯）和膽汁淤積（表現(xiàn)為無毛區(qū)黃疸、尿色深黃、陶土樣大便）癥狀。肝臟大體觀可見明顯黃染，表面呈顆粒狀，肝外膽管呈索條狀閉鎖，膽囊顯示不清，組織切片蘇木素伊紅染色（HE）顯示肝內(nèi)外膽管閉鎖；其中壽命達(dá)到或超過21d的小鼠僅4只（包括21天取材2只），比例為6.25％；無小鼠退黃（0％）；193只IL-6 抗體組小鼠中，5μg、15μg、20μg 注射劑量組各48只，分別有34只（73.91％）、33只（70.21％）、29只

8、（61.71％）出現(xiàn)上述表現(xiàn)，25μg 注射劑量組49只，有25只（52.08％）小鼠出現(xiàn)上述表現(xiàn)，顯著低于病毒對照組；壽命超過或達(dá)到21d的BA 小鼠2只，比例為9.52％；4只小鼠自然退黃，體重逐漸恢復(fù)，比例為16％，顯著高于病毒對照組；31只對照組小鼠觀察至21天沒有上述表現(xiàn)。病毒對照組小鼠肝組織內(nèi)Foxp3，IL-17，ROR-γt mRNA表達(dá)在第7-10天顯著高于正常組和25ug 劑量的IL-6 抗體組。體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病毒

9、對照組小鼠DC細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-6 明顯增高；病毒對照組小鼠T細(xì)胞+DC細(xì)胞+TGF-β培養(yǎng)上清中IL-17表達(dá)增高；DC細(xì)胞TLR3、7、8的表達(dá)顯著高于對照組。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1．BA 患兒中Th17細(xì)胞增多、IL-17 水平增高而Treg細(xì)胞相對減少在BA的進(jìn)行性免疫炎癥中發(fā)揮重要作用。
　　 2．BA中DC細(xì)胞通過TLRs 識別病原微生物而活化，分泌大量IL-6，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，而抑制T