肺癌微環(huán)境中淋系樹突狀細胞誘導調(diào)節(jié)性T細胞增殖促進腫瘤免疫逃逸的實驗和臨床研究.pdf

1、第一部分:肺癌組織中樹突狀細胞和調(diào)節(jié)性T細胞浸潤及分布
　　目的：檢測肺癌組織及外周血中樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）亞群和調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Treg）的浸潤比例，探討三種免疫細胞間的相關(guān)性及其臨床意義。
　　方法：收集14例肺癌患者手術(shù)切除的肺癌組織（Tumor tissue）和癌旁肺組織（Paratumor tissue），同時留取8例患者外周血和10例健康志愿者的外周

2、血。肺癌、癌旁組織經(jīng)過消化、研磨，密度梯度離心分選出單個核細胞群體。以HLA-DR+CD11c+Lineage-作為髓系樹突狀細胞（Myeloid DC，mDC）的分子標記， HLA-DR+CD123+Lineage-作為淋系樹突狀細胞（Plasmacytoid DC，pDC）的分子標記， CD4+CD25+CD127-作為調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells， Treg）的分子標記。應用流式細胞術(shù)（Flow Cytome

3、try，F(xiàn)C）檢測上述標本中DC和Treg的浸潤及其表面趨化因子受體表達情況。應用 RT-PCR技術(shù)檢測肺癌組織和癌旁組織中相關(guān)趨化因子mRNA表達情況。
　　結(jié)果：肺癌組織、癌旁組織及外周血中均可檢測到 CD4+CD25+CD127-Treg、HLA-DR+CD123+Lineage-mDC和HLA-DR+CD11c+Lineage-pDC的浸潤表達。
　　1．肺癌腫瘤浸潤單個核細胞（Tumor infiltrating

4、mononuclear cell，TIMC）中Treg比例為(7.11±2.77)%，癌旁組織單個核細胞（Para-tumor infiltrating mononuclear cell， PIMC）中浸潤Treg比例為(2.95±0.55)%，腫瘤組織中Treg比例明顯高于癌旁組織，兩組間差異有統(tǒng)計學意義，p﹤0.05。Ⅲ～Ⅳ期肺癌腫瘤組織中Treg細胞比例明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，p﹤0.05。癌旁正常肺組織中Treg細胞在各期肺癌中的比例

5、無明顯差異， p﹥0.05。淋巴轉(zhuǎn)移組的肺癌患者Treg細胞比例顯著高于未轉(zhuǎn)移組，p﹤0.05。在不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、病理類型的患者中，Tr e g的浸潤比例差異無統(tǒng)計學意義。
　　2．肺癌腫瘤組中 pDC細胞比例為（3.49±2.04）%，癌旁組織中 pDC細胞比例為（0.89±0.67）%，腫瘤組織中 pDC細胞比例明顯高于癌旁組織，兩組間差異有統(tǒng)計學意義，p﹤0.05；肺癌組織中mDC細胞比例為（1.24±0

6、.98）%，癌旁組織中mDC細胞比例為（0.90±0.86）%，腫瘤組織中mDC細胞比例和癌旁組織相比無明顯差異， p﹥0.05；Ⅲ～Ⅳ期肺癌腫瘤組織中 pDC細胞比例較Ⅰ～Ⅱ期明顯增高(4.59±0.85)vs(2.40±0.42)，差異有統(tǒng)計學意義，p﹤0.05。Ⅲ～Ⅳ期肺癌腫瘤組織中mDC細胞的比例和Ⅰ～Ⅱ期相比(1.37±0.46)vs(1.10±0.31)，差異無統(tǒng)計學意義，p﹥0.05。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中 pDC浸潤

7、比例明顯高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(5.20±1.01)vs(2.54±0.39)，差異有統(tǒng)計學意義，p﹤0.05；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中mDC浸潤比例不高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的肺癌組織(1.38±0.36)vs(1.16±0.38)，差異無統(tǒng)計學意義，p﹥0.05。在不同的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、病理類型組的患者中，mDC和pDC的浸潤比例差異無統(tǒng)計學意義p﹥0.05。
　　3.其中有8例患者同時取得了肺癌組織、癌旁組織

8、和外周血。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述三種標本中，Treg的比例分別為（6.95±1.14）%、（3.10±0.15）%和（2.10±0.27）%；pDC的比例分別為（3.18±0.85）%、（0.76±0.18）和（1.02±0.16）%；mDC細胞的比例分別為（1.38±0.40）%、（1.13±0.33）%和（1.00±0.17）%。肺癌組織中Treg、pDC浸潤比例均明顯高于癌旁肺組織和外周血，且二者呈正相關(guān)性，p﹤0.05。而mDC在腫瘤組

9、織、癌旁正常組織及外周血相比無明顯差異。提示肺癌腫瘤微環(huán)境中Treg和pDC兩種細胞存在聚集傾向。
　　4.和相應外周血相比，腫瘤浸潤Treg表面CCR4、CCR6和CXCR1表達率明顯上調(diào)，而其相應配體CCL20、CCL22和CXCL8mRNA等在癌旁組織中也明顯增高。提示 Treg在肺癌組織中的聚集存在趨化動力。而上述趨化因子受體在腫瘤浸潤及外周血pDC中均無明顯表達。
　　5.肺癌組織較癌旁組織中 CD4+/CD8+T

10、淋巴細胞比值上調(diào)（2.52±0.23）% vs（1.91±0.11）%，p﹤0.05。而且肺癌組織中CD4+/CD8+T細胞比值和Treg浸潤比例呈正相關(guān)關(guān)系，提示Treg可能影響了CD4+/CD8+T細胞的極性改變。
　　結(jié)論：肺癌腫瘤微環(huán)境中pDC和Treg的浸潤比例明顯高于癌旁組織和患者外周血，提示兩種細胞腫瘤微環(huán)境中的集結(jié)存在一定的關(guān)聯(lián)，pDC可能通過某種方式對Treg的數(shù)量和功能產(chǎn)生影響；定向遷移可能是Treg在肺癌腫瘤

11、微環(huán)境中聚集的重要機制之一。pDC、Treg和CD4+/CD8+T細胞比值失衡相關(guān)聯(lián)，提示肺癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞已經(jīng)出現(xiàn)朝著有利于肺癌發(fā)生免疫逃逸的方向轉(zhuǎn)變。
　　第二部分:肺癌惡性胸水中DC和Treg的表型特征、生物學功能及其與肺癌腫瘤免疫逃逸相關(guān)機制初探
　　目的：檢測肺癌惡性胸水微環(huán)境中Treg和DC亞群的表型特征、生物學功能及其和胸水微環(huán)境的關(guān)系。探討pDC誘導Treg增殖的能力和相關(guān)機制。
　　方法：收集

12、18例晚期肺癌惡性胸水及患者外周血、10例結(jié)核性胸膜炎良性胸水和健康對照組外周血。制備胸水單個核細胞懸液。在標記確認DC亞群和Treg分子標志的基礎上加標PD-1、PD-L1及相關(guān)抗體，檢測Treg表面 PD-1分子和DC表面PD-L1分子的表達比例，分析PD-1+Treg與PD-L1+pDC和PD-L1+mDC的相關(guān)性。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent test;enzyme linked

13、immunosorbent assay，ELISA)檢測患者外周血及胸水上清中相關(guān)細胞因子 TGF-β、IL-10和IFN-γ的濃度，并探討細胞因子濃度和Treg、DC浸潤比例之間的相關(guān)性。應用流式細胞儀無菌分選惡性胸水中pDC和Treg，探討pDC誘導Treg增殖的能力及其相關(guān)機制。
　　結(jié)果：1.惡性胸水及其外周血中 Treg的浸潤比例分別為（13.04±4.31）%和（2.64±0.76）%，Treg表面PD-1分子表達比例

14、分別為（18.64±6.93）%和（3.49±2.45）%，肺癌惡性胸水Treg比例及其表面PD-1的比例均明顯高于其外周血。
　　2.肺癌惡性胸水和外周血中pDC的浸潤比例分別為（6.27±2.65）%和（1.29±0.55）%；pDC表面PD-L1分子的表達率分別為（31.93±8.56）%和（5.60±3.74）%；肺癌惡性胸水和外周血中 mDC的浸潤比例分別為（0.52±0.26）%和（1.26±0.54）%， mDC表面

15、PD-L1分子的表達率分別為（14.39±8.43）%和（15.66±6.61）%。肺癌惡性胸水中pDC及其表面PD-L1分子表達比例明顯高于其外周血，而mDC及其表面PD-L1分子表達比例在惡性胸水及外周血之間相比無明顯差異。
　　3.相關(guān)性分析顯示：PD-1+Treg/Treg比值和PD-L1+pDC/pDC的比值呈正相關(guān)關(guān)系（Y=0.6890*X+19.09， R2=0.3107， p=0.0162）， PD-1+Treg/

16、Treg比值和PD-L1+mDC/mDC比值無明顯相關(guān)性（Y=-0.4359*X+22.52，R2=0.1282，p=0.1445），提示pDC和Treg的增加存在一定的關(guān)聯(lián)，可能和PD-1/PD-L1信號途徑有關(guān)。
　　4. ELISA檢測結(jié)果顯示，惡性胸水上清、胸水患者外周血、結(jié)核性胸水上清和健康志愿者外周血中 IL-10含量分別為（432.8±96.7） ng/L、（261.7±36.3） ng/L、（154.2±19.1）

17、ng/L和（171.7±21.3）ng/L，TGF-β含量分別為（76.6±32.3）ng/L、（30.07±15.9）ng/L、（20.6±13.8）ng/L和（15.78±12.6）ng/L，IFN-γ含量分別為（45.6±12.4）ng/L、（229.3±68.6）ng/L、（688.9±236.8）ng/L和（444.5±113.8）ng/L，和外周血、良性胸水相比，肺癌惡性胸水中 IL-10、TGF-β表達增加，IFN-γ表達

18、減少，相關(guān)性分析顯示，胸水浸潤Treg比例和IL-10含量呈正相關(guān)，和IFN-γ呈負相關(guān)， pDC和胸水細胞因子含量無明顯相關(guān)性，提示惡性胸水中負性抑制性細胞因子存在上調(diào)表達。
　　5.細胞增殖和抗體阻斷試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：空白對照組、DC誘導組、抗體阻斷組和同型對照組增殖細胞 OD值分別為（0.38±0.02）、（0.63±0.06）、（0.36±0.05）和（0.35±0.03）。IL-10表達率分別為（0.38±0.02）%、（0

19、.63±0.06）%、（0.36±0.05）%和（0.35±0.03）%。TGF-β表達率分別為（11.02±1.75）%、（8.70±3.94）%、（12.73±2.48）%和（8.37±3.49）%。與空白對照組及抗體阻斷組相比，DC誘導組和同型對照組細胞OD值及IL-10表達水平均明顯提高，提示惡性胸水分離純化的pDC可以有效誘導Treg的增殖和IL-10的分泌，在加入antiPD-L1后， pDC誘導Treg增殖和IL-10的分

20、泌的能力明顯減弱，提示PD-1/PD-L1信號途徑在pDC誘導Treg增殖的過程中扮演了重要角色。
　　結(jié)論：惡性胸水微環(huán)境中pDC和Treg浸潤比例增加并存在正相關(guān)性，體外實驗證實 pDC可以誘導 Treg增殖和 IL-10分泌，PD-L1抗體可以阻斷這一效應。提示PD-1/PD-L1信號途徑是導致肺癌惡性胸水微環(huán)境中pDC和Treg上調(diào)的重要影響因素。Treg增殖和分泌功能活化可能導致胸水中IL-10含量的進一步增加，加速營造

21、了惡性胸水中相對“負性”的腫瘤微環(huán)境。上述變化可能誘導更多的免疫抑制性細胞群體的活化、效應細胞的極性轉(zhuǎn)化甚至抑制腫瘤殺傷細胞的功能，進而有利于肺癌細胞發(fā)生免疫逃逸。
　　第三部分:肺癌組織中pDC和Treg細胞浸潤的臨床意義
　　目的：檢測pDC和Treg在非小細胞肺癌組織中的浸潤表達及分布情況，分析兩種細胞浸潤和肺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，探討其在判斷患者生存預后中的價值。
　　方法：以BDCA2作為腫瘤浸潤pDC

22、的分子標記，F(xiàn)oxp3作為腫瘤浸潤Treg的分子標記。利用免疫組織化學染色方法對離體肺癌組織石蠟包埋標本中浸潤的 pDC和Treg進行檢測。利用Kaplan-Meier曲線計算患者的累積生存率，構(gòu)建Cox模型對影響患者生存預后的因素進行預測。
　　結(jié)果：1.肺癌組織中可檢測到胞漿和胞核均呈棕色顆粒的 Foxp3+細胞，該群細胞主要分布在腫瘤細胞區(qū)域外以及癌巢邊緣區(qū)域。Foxp3+Treg細胞在腫瘤組織中的陽性表達率高于癌旁組織〔（