肺炎鏈球菌DnaJ調(diào)節(jié)樹突狀細胞誘導T細胞免疫應答的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn）是一種革蘭陽性的條件致病菌，能夠引起腦膜炎、敗血癥和社區(qū)獲得性肺炎等多種侵襲性疾病。耐藥菌的廣泛出現(xiàn)使得疫苗預防成為控制S.pn感染的有效策略。肺炎鏈球菌DnaJ是一種與S.pn毒力相關的熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）,屬于Hsp40家族，作為疫苗經(jīng)鼻腔或腹腔免疫小鼠，能夠誘導小鼠產(chǎn)生抗S.pn感染的保護性免疫應答，但是

2、其具體免疫應答機制不清。研究DnaJ誘導宿主免疫應答的機制有助于S.pn疫苗的研發(fā)。
　　樹突狀細胞（dendritic cell,DC）是已知的最有效的專職抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC），在抗病原體的固有免疫和適應性免疫中都發(fā)揮重要作用。在其他細菌中發(fā)現(xiàn)多種熱休克蛋白可以活化DC[1,2]。最近在S.pn中也發(fā)現(xiàn)，Hsp100/ClpP可以被Toll-樣受體4(Toll-like rese

3、ptor4,TLR4)識別，通過活化MAPK和NF-κB信號通路誘導DC活化和成熟，從而啟動Th1免疫應答[3]。然而，作為一種熱休克蛋白，肺炎鏈球菌DnaJ能否誘導DC的成熟、介導DC成熟的分子機制，以及對T細胞的極化情況還未見報道。
　　在本研究中，我們旨在研究肺炎鏈球菌DnaJ介導DC成熟的效能及其誘導T細胞免疫應答的機制。
　　方法：
　　1.利用大腸桿菌原核表達DnaJ重組蛋白(recombinant Dna

4、J,rDnaJ)純化并去除LPS。
　　2.研究rDnaJ蛋白誘導DC活化的機制
　　(1)rDnaJ蛋白作用于小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)，流式細胞術（flow cytometry,FCM）檢測BMDC上 MHCII、CD86、CD40的表達；ELISA檢測細胞因子TNF-α、IL-6和IL-12p40的分泌情況。
　　(2)rDnaJ蛋白刺

5、激TLR2 KO、TLR4 KO小鼠和WT小鼠來源的BMDC后，F(xiàn)CM檢測MHCII、CD86、CD40的表達；ELISA檢測細胞因子TNF-α和IL-6的分泌情況。
　　(3)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,

6、PI3K)抑制劑抑制劑預處理BMDC后，ELISA檢測rDnaJ其對TNF-α和IL-6分泌的影響；Western blot檢測MAPK、NF-κB和Akt的磷酸化水平。
　　3.研究rDnaJ蛋白誘導T細胞的免疫應答機制
　　(1)體外實驗檢測rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進T細胞分化中的作用。
　　rDnaJ蛋白刺激后的DC與CD4+T細胞共培養(yǎng)36h，ELISA檢測培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4和IL-17A的表

7、達；FCM分別檢測IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IL-17A+CD4+細胞的百分比。
　　(2)過繼轉(zhuǎn)移實驗檢測rDnaJ蛋白活化的BMDC在促進T細胞分化中的作用。
　　分別在第0、14和28d,將rDnaJ蛋白刺激后的BMDC經(jīng)腹腔過繼轉(zhuǎn)移到WT小鼠體內(nèi)。取小鼠脾細胞，在體外經(jīng)rDnaJ蛋白再次刺激36h后，ELISA檢測脾細胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。
　　(3)體內(nèi)實驗檢測TLR

8、2和TLR4在誘導T細胞應答中的作用
　　將WT、TLR2 KO小鼠和TLR4 KO小鼠各分為3組：CT+rDnaJ蛋白組、CT組和PBS組。在第0、7和14d免疫小鼠后，用rDnaJ蛋白刺激免疫小鼠脾細胞3d后，ELISA檢測IFN-γ、IL-4和IL-17A水平。
　　結果：
　　1.成功構建了原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-dnaJ，誘導表達后獲得了高純度的rDnaJ蛋白；并且采用PmB-agarose去除蛋白

9、溶液中的LPS，使LPS殘留量不影響后續(xù)實驗。
　　2.成功培養(yǎng)了小鼠BMDC，其純度達80％以上。
　　3.rDnaJ蛋白能夠誘導小鼠BMDC成熟，促使BMDC高表達細胞表面分子（MHCII、CD86和 CD40）以及分泌細胞因子TNF-α、IL-6和IL-12p40。
　　4. rDnaJ蛋白通過TLR4受體誘導小鼠BMDC成熟，與TLR2無關。
　　5.rDnaJ蛋白通過p38、ERK、JNK、PI3K-A

10、kt和NF-κB等信號通路誘導小鼠BMDC成熟。
　　6. rDnaJ蛋白通過TLR4刺激成熟的小鼠BMDC使初始CD4+T細胞向Th1和Th17細胞極化，誘導宿主產(chǎn)生Th1和Th17型免疫應答。
　　結論：
　　本研究表明rDnaJ蛋白能夠誘導強烈的BMDC免疫應答，該免疫應答是通過TLR4受體而不是TLR2受體、在MAPK、PI3K-Akt和NF-κB多條信號通路的參與下完成的。成熟BMDC可以使初始T細胞向Th1