紅霉素體外誘導(dǎo)肺炎鏈球菌耐藥的研究.pdf

1、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）是引起中耳炎、鼻竇炎、支氣管炎以及社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，是引起人類死亡的重要原因之一?？股乇粡V泛運(yùn)用于治療此類感染，然而隨著抗生素的運(yùn)用，耐藥性日趨嚴(yán)重，如此對(duì)耐藥機(jī)制的研究顯得尤為重要。但目前對(duì)耐藥機(jī)制的研究主要是通過臨床分離耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株之間的對(duì)比來進(jìn)行探討，對(duì)于S.pneumoniae能否通過體外誘導(dǎo)耐藥，通過誘導(dǎo)耐藥株與原始菌株

2、之間的對(duì)比探討耐藥機(jī)制的研究尚未發(fā)現(xiàn)。 本課題通過瓊脂稀釋法測(cè)定MIC值獲得對(duì)紅霉素敏感的Spneumoniae標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株；將S.pneumoniae接種于含紅霉素的血瓊脂平板上進(jìn)行耐藥性誘導(dǎo)，紅霉素濃度由0.5MIC逐倍遞增，直至敏感株變?yōu)槟退幹?，測(cè)定耐藥株MIC值；將獲得的耐藥子代在無紅霉素血瓊脂平板上連續(xù)傳代20次后，測(cè)定其MIC值，以檢測(cè)其獲得耐藥的穩(wěn)定性；對(duì)比分析誘導(dǎo)耐藥前后Spneumoniae生理生化學(xué)性

3、質(zhì)的變化；小鼠毒力試驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)耐藥前后試驗(yàn)菌株毒力的改變。PCR與RT-PCR對(duì)誘導(dǎo)耐藥前后受試菌株rplD、rplV基因以及23SrRNA擴(kuò)增并測(cè)序；CPHmodels-2.0蛋白質(zhì)空間構(gòu)象預(yù)測(cè)系統(tǒng)對(duì)誘導(dǎo)耐藥前后受試菌株rplD、rplV基因編碼的核糖體蛋白L4和L22進(jìn)行空間構(gòu)象預(yù)測(cè)分析，并運(yùn)用PyMOL蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)其表面空間構(gòu)象進(jìn)行分析。 通過試驗(yàn)篩選獲得的試驗(yàn)菌株MIC值均為0.0312mg/L；誘導(dǎo)后標(biāo)準(zhǔn)菌株tig

4、r4MIC值增加到256mg/L，臨床分離株C1和C2MIC值均增加到32mg/L，標(biāo)準(zhǔn)菌株R6MIC值未發(fā)生變化；耐藥子代在連續(xù)傳代20次后，其MIC值未發(fā)生改變；經(jīng)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)耐藥前后S.pneumoniae菌落特征、鏡下形態(tài)以及對(duì)Optochin敏感性未發(fā)生改變；小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)耐藥前后S.pneumoniae毒力未發(fā)現(xiàn)明顯改變（P>0.05）；誘導(dǎo)耐藥前后測(cè)序結(jié)果對(duì)比顯示標(biāo)準(zhǔn)菌株tigr4核糖體蛋白L4發(fā)生V32A變異，

5、L22發(fā)生D35G變異；而臨床分離敏感株核糖體蛋白L4發(fā)生Q67R、K68E變異；空間構(gòu)象分析核糖體蛋白L22的D35G及核糖體蛋白L4的Q67R、K68E變異導(dǎo)致其相應(yīng)的表面空間構(gòu)象發(fā)生明顯改變。 綜上所述，Spneumoniae可通過紅霉素體外誘導(dǎo)而導(dǎo)致耐藥，并且該獲得性耐藥穩(wěn)定性較好；誘導(dǎo)耐藥前后S.pneumoniae生理生化學(xué)性質(zhì)及毒力未發(fā)生明顯改變；紅霉素結(jié)合域發(fā)生新的變異是S.pneumoniae耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素