肺炎鏈球菌聯(lián)合多肽疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，S.pn)是肺炎，腦膜炎和中耳炎的主要病因，引起全世界范圍內(nèi)嬰幼兒，老年人和免疫缺陷個(gè)體疾病的主要病原菌。隨著耐藥菌株的不斷發(fā)現(xiàn)，疫苗在其感染防治中的作用越來越重要。目前主要所用的是23價(jià)肺炎多糖疫苗和7價(jià)結(jié)合疫苗，但前者覆蓋的血清型有限而且不是T細(xì)胞依賴性的，對免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下小孩和老年人的保護(hù)性弱；后者存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換和載體攜帶的莢膜多糖血清型數(shù)量有限

2、以及在肺炎高發(fā)人群中的保護(hù)作用小等問題，并且生產(chǎn)成本很高，不適合在發(fā)展中國家大量使用。因此發(fā)展肺炎鏈球菌蛋白疫苗迫在眉睫。 肺炎鏈球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)是S.pn主要的毒力因子之一，在肺炎鏈球菌侵襲性感染時(shí)起著重要的作用，它是最早作為S.pn蛋白質(zhì)疫苗的候選抗原之一；S.pn膽堿結(jié)合蛋白A(choline binding protein A,CbpA)作為S.pn

3、的最為重要的表面蛋白成分之一，在S.pn引起腦膜炎時(shí)功能獨(dú)特，是最關(guān)鍵的毒力因子。而S.pn熱休克蛋白ClpP(caseinolytic protease)在S.pn從呼吸道(大約30到34℃)轉(zhuǎn)移到血液和(或)腦膜(37℃)，幫助S.pn適應(yīng)宿主環(huán)境從而致病的過程中發(fā)揮著重要的功能。 因此，本研究擬對上述三種保護(hù)性抗原進(jìn)行克隆表達(dá)，通過三種抗原間的不同組合方式來探索聯(lián)合多肽疫苗相對于單一多肽成分的優(yōu)勢性，并利用抗體被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)

4、來驗(yàn)證保護(hù)作用。 方法：1.用引物修飾法將S.pn基因組中擴(kuò)增PspA,CbpA和ClpP片段并構(gòu)建在原核表達(dá)載體PET-32a中。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的TIGR4型S.pn全基因組序列進(jìn)行相似性分析。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，鎳柱親和層析純化蛋白。應(yīng)用SDS-PAGE對表達(dá)和純化產(chǎn)物進(jìn)行分析，透析除鹽，并用抗組氨酸單克隆抗體Wes

5、tem blot鑒定。純化的重組抗原分別免疫BALB/C小鼠，制備相應(yīng)多克隆抗體血清。2.主動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，將96只BALB/C小鼠隨機(jī)分為8組(每組12只)：對照組，PspA組，CbpA組，ClpP組，PspA+CbpA混合組，PspA+ClpP混合組，CbpA+ClpP混合組，PspA+CbpA+ClpP混合組。分別于0.14.28天經(jīng)腹腔注射免疫，劑量為10 ug/次/種抗原。末次免疫后7天，每只小鼠經(jīng)眼眶取血，ELISA檢測免疫

6、后血清特異IgG以證實(shí)高效價(jià)抗體的產(chǎn)生。7天后，每只小鼠經(jīng)腹腔感染TIGR4型肺炎鏈球菌，連續(xù)監(jiān)測21天小鼠的生存時(shí)間，計(jì)算各組的生存率。3.抗體被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，將96只BALB/C小鼠隨機(jī)分為8組(每組12只)：對照組，Anti-PspA血清組，Anti-CbpA血清組，Anti-ClpP血清組，Anti-PspA+Anti-CbpA血清混合組，Anti-PspA+Anti-ClpP血清混合組，Anti-CbpA+Anti-ClpP

7、血清混合組，Anti-PspA+Anti-CbpA+Anti-ClpP血清混合組。分別經(jīng)腹腔注射免疫，劑量為100 ul抗血清/只/種抗血清。免疫24小時(shí)后，每只小鼠經(jīng)腹腔感染TiGR4型肺炎鏈球菌，連續(xù)監(jiān)測21天小鼠的生存時(shí)間，計(jì)算各組的生存率。 結(jié)果：1.經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，S.pn PspA基因片段被正確克隆到PET-32a原核表達(dá)載體中。PspA基因片段的核苷酸序列長度為1329bp，與GeneBank中序列比

8、較，無堿基突變。重組工程菌IPTG誘導(dǎo)，在BL21(DE3)菌中表達(dá)出了分子量約為66kD的Trx-PspA融合蛋白。重組蛋白以可溶形式表達(dá)，表達(dá)量約占全菌蛋白的40％；經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后得到了純度>90％的重組蛋白。PspA重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備多克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示抗體能夠與S.pn菌體蛋白起反應(yīng)。2.經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建出原核表達(dá)載體pET32a(+)/CbpA。將重組子轉(zhuǎn)化

9、至大腸桿菌BL21(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出了分子量約為80kD的Trx-CbpA融合蛋白。重組蛋白以可溶形式表達(dá)，表達(dá)量約占全菌蛋白的20％；經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后得到了純度>90％的重組蛋白。CbpA重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備多克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示抗體能夠與S.pn菌體蛋白起反應(yīng)。3.重組工程菌pET32a(+)/ClpP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)重組工程菌IPTG誘導(dǎo)，在BL21(DE3)菌中表達(dá)出

10、了分子量約為42kD的Trx-PspA融合蛋白。重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量約占全菌蛋白的35％；經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后得到了純度>90％的重組蛋白。ClpP重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備多克隆抗體，Westem blot結(jié)果顯示抗體能夠與S.pn菌體蛋白起反應(yīng)。 4.重組蛋白的主動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，單一重組蛋白及混合組份經(jīng)腹腔免疫BALB/C小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體后，致死量的TIGR4腹腔感染。與對照組相比，抗原免疫組小鼠半數(shù)生存時(shí)

11、間明顯延長(P<0.05)。與其他抗原免疫組小鼠相比，三種亞單位重組蛋白免疫組半數(shù)生存時(shí)間最長(P<0.05)。PspA免疫只能延長小鼠的生存時(shí)間而不能防止其死亡，三種亞單位重組蛋白免疫組保護(hù)率為100％，與其他組小鼠(ClpP和PspA混合免疫組除外)相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5.抗體的被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，與對照組相比，抗體免疫組小鼠生存時(shí)間明顯延長(P<0.001)。三種抗體(Anti-PspA+Anti-CbpA+Ant

12、i-ClpP)混合免疫組與單一抗體免疫組相比，半數(shù)生存時(shí)間明顯延長(P<0.025)。PspA多克隆抗體血清同樣只能延長小鼠生存時(shí)間而不能防止其死亡。與單一抗體免疫組小鼠相比，三種抗體混合免疫組保護(hù)效率最高(P<0.05)。 結(jié)論：1.成功構(gòu)建了pET32a(+)/PspA，pET32a(+)/CbpA，pET32a(+)/ClpP原核表達(dá)載體。純化的重組蛋白PspA，CbpA和ClpP，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可以作為

13、S.pn基因工程疫苗的候選抗原。2.成功制備了重組蛋白PspA，CbpA和ClpP的多克隆抗血清，它們都能和肺炎鏈球菌菌體蛋白發(fā)生特異性的反應(yīng)。3.亞單位疫苗主動(dòng)免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示它們能夠保護(hù)BALB/C小鼠抵抗致死量TIGR4型S.pn的攻擊，其中三種疫苗蛋白混合免疫能夠產(chǎn)生很好的保護(hù)效果，為進(jìn)一步的S.pn多肽聯(lián)合疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。4.抗血清的被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白的多克窿抗體能夠能夠保護(hù)BALB/C小鼠抵抗致死量TI