抗肺炎鏈球菌工程多肽體內(nèi)外抗菌活性研究.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus Pneumoniae，SP)是細(xì)菌感染性疾病的主要病原菌，它可引起機(jī)體局部和全身的多種感染，在世界人群中有較高的發(fā)病率和死亡率，患者主要是老人和2個(gè)月-2歲的嬰幼兒。近年來(lái)，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥情況日漸嚴(yán)重，肺炎鏈球菌也不例外，耐青霉素及多重耐藥肺炎鏈球菌在許多國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道，流行病學(xué)呈明顯的上升趨勢(shì)，為人類治療肺炎鏈球菌感染又提出新的挑戰(zhàn)。因此迫切需要發(fā)展新型的抗菌素。 大

2、腸菌素是大腸桿菌分泌的一種細(xì)菌素?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的大腸菌素達(dá)25種之多。由于它們只能識(shí)別同種異株大腸桿菌外膜和內(nèi)膜上的特異受體，因此大腸菌素只對(duì)近緣菌株具有殺傷作用。大腸菌素的作用方式可分為三種：即形成離子通道使膜去極化(E1族)、降解DNA及抑制蛋白質(zhì)的合成(E3族)。大腸菌素Ia屬于可形成離子通道的E1族大腸菌素，1978年證實(shí)其工作機(jī)制是在靶細(xì)胞膜上形成電壓依賴性離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，能量衰竭，而致細(xì)菌死亡。這種殺傷方式極為有效

3、，當(dāng)大腸菌素的濃度等于甚至小于0.1nmol時(shí)仍然能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的有效攻擊。處于同一環(huán)境中的細(xì)菌并非孤立存在，而是進(jìn)行著相互間的“通訊”，它們通過(guò)自身分泌和感應(yīng)特定的信號(hào)分子來(lái)完成信息交流。很早就知道肺炎鏈球菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力，轉(zhuǎn)化的發(fā)生需要細(xì)菌細(xì)胞處于特殊的狀態(tài)——感受態(tài)，肺炎鏈球菌的感受態(tài)就是由胞外的信息素一感受態(tài)刺激因子誘導(dǎo)形成的。感受態(tài)刺激因子(Competence-StimulatingPeptide，CSP)是一個(gè)由17個(gè)氨

4、基酸殘基組成的多肽，由肺炎鏈球菌在自身生長(zhǎng)過(guò)程中持續(xù)小量地分泌至胞外，為comC基因的表達(dá)終產(chǎn)物。生長(zhǎng)中的細(xì)菌其comCDE操縱予以較低的水平被轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致CSP在培養(yǎng)基中的緩慢累積。達(dá)細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的早期至中期，分泌至胞外的CSP累積達(dá)到閾值濃度(2-10ng/m1)時(shí)，即在介質(zhì)中主動(dòng)找尋同株肺炎鏈球菌胞膜上的ComD受體，與之結(jié)合，并激活細(xì)胞內(nèi)二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)(ComDE)，誘導(dǎo)靶細(xì)胞感受肽調(diào)節(jié)子(com)的表達(dá)。據(jù)此可知CSP與其他已

5、發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌信息素一樣具有自主導(dǎo)向(autoinducing)的特性。基于肺炎鏈球菌信息素(CSP)的自主導(dǎo)向特性和大腸菌素Ia的致死性離子通道特性，本室利用分子生物學(xué)的方法構(gòu)建出一類多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)分子機(jī)器——抗肺炎鏈球菌工程多肽(Pheromonicin-Streptococcus Pneumoniae,Ph-SP)。本研究的目的在于初步評(píng)價(jià)純化的Ph-SP的抗菌活性及抗菌特點(diǎn)。 方法： 將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入工程菌

6、TGl制備工程多肽(Ph-SP)，經(jīng)透析、離子交換柱純化后，通過(guò)體外抗菌試驗(yàn)和體內(nèi)感染保護(hù)試驗(yàn)檢測(cè)其抗菌活性。體外實(shí)驗(yàn)部分采用液體培養(yǎng)法檢測(cè)Ph-SP對(duì)肺炎鏈球菌(CMCC31001、CMCC31302)的抗菌活性，并將Ph-SP與臨床常用的幾種抗生素對(duì)肺炎鏈球菌的抗菌效力進(jìn)行比較。采用最小殺菌濃度和殺菌曲線的方法，觀察Ph-SP的殺菌作用：體內(nèi)部分選用KM小鼠，經(jīng)腹腔感染肺炎鏈球菌(CMCC31302)建立全身感染模型后，分別給予不同

7、劑量的Ph-SP及對(duì)照藥物，觀察小鼠10天存活情況，繪制生存曲線圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Ph-SP從100ng/ml逐漸增至1μg/ml時(shí)，對(duì)肺炎鏈球菌的抑制作用不斷增強(qiáng)，并呈明顯的劑量依賴性。與幾種常用的抗生素進(jìn)行比較，按照單位體積內(nèi)相同藥物分子數(shù)量進(jìn)行校正，分別是青霉素及萬(wàn)古霉素抗菌效力的200倍和50倍。在相同摩爾濃度下(71.4nmol/L)，Ph-SP完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)，而頭孢噻肟鈉、苯唑青霉素、紅霉素只

8、能抑制細(xì)菌12小時(shí)的生長(zhǎng)。殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說(shuō)明Ph．SP是一種對(duì)靶細(xì)菌有殺傷作用的工程多肽，它對(duì)靶細(xì)菌的攻擊是致死性的。Ph-SP在攻擊靶細(xì)菌時(shí)表現(xiàn)出較好的特異性。在實(shí)驗(yàn)濃度下它對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、綠膿桿菌(CGMCCl.2387)、臨床分離菌株腸球菌、大腸桿菌及陰溝腸桿菌均未表現(xiàn)出抑菌活性。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Ph-SP對(duì)肺炎鏈球菌感染小鼠體內(nèi)抗菌活性也較強(qiáng)，對(duì)照組小鼠在24小時(shí)全部死亡的情況下，經(jīng)尾靜脈給予實(shí)

9、驗(yàn)組小鼠3.3mg／kg的Ph-SP，能使小鼠的10天存活率達(dá)80％，而增加到6.6mg／kg時(shí)，全部小鼠均存活10天，存活率為100％。在相同劑量下(3.3mg／kg)，對(duì)照組和野生型大腸菌素I a組均在24小時(shí)內(nèi)全部死亡，青霉素組在48小時(shí)內(nèi)全部死亡，萬(wàn)古霉素組感染10天后僅存活2只，存活率為20％。Ph-SP表現(xiàn)出了超出試驗(yàn)中所用抗菌素的體內(nèi)感染保護(hù)作用，感染10天后的存活數(shù)為9只，存活率達(dá)到90％。 綜上所述：構(gòu)建的Ph