鏈球菌DNA疫苗的構(gòu)建及其初步應(yīng)用.pdf

1、奶牛乳房炎是奶牛的一種多發(fā)病、常見病，導(dǎo)致了奶牛場的巨大經(jīng)濟損失。鏈球菌(停乳鏈球菌，乳房鏈球菌和無乳鏈球菌)是奶牛乳房炎主要致病菌種之一。用疫苗來防治奶牛乳房炎具有良好的應(yīng)用前景，目前鏈球菌疫苗的研究集中于滅活疫苗和亞單位疫苗，并且效果都不理想。DNA疫苗所表達的外源抗原具有與天然抗原相同的構(gòu)象和免疫原性，可以同時激發(fā)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫。 本課題目的：利用分子佐劑牛C3d改造真核表達載體，同時選擇多種保守性的關(guān)鍵抗原靶

2、位基因，構(gòu)建免疫增強型重組鏈球菌DNA疫苗，經(jīng)免疫接種小鼠動物模型，考察疫苗的體液免疫，細胞免疫效果，探討其作為鏈球菌奶牛乳房炎防治疫苗的可行性。 首先以牛肝總RNA為模板，通過RT-PCR獲得牛C3d基因，運用pSec Tag2質(zhì)?？寺『蛯崿F(xiàn)分子C3d的偶聯(lián)，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSec Tag2-C3d3，然后將C3d3克隆到pcDNA3.1中，并引入Kozak促真核翻譯序列，成功構(gòu)建了免疫增強DNA疫苗載體pcDNA3.1-

3、C3d3。然后以停乳鏈球菌基因組為模板PCR擴增獲得廣泛存在于鏈球菌表面的脫氫酶GapC基因和停乳鏈球菌纖粘連蛋白結(jié)合因子FnBB的功能單位B3片段，并以此為抗原基因克隆到載體pcDNA3.1和pcDNA3.1-C3d3中分別構(gòu)建四種DNA疫苗pcDNA3.1-GapC,pcDNA3.1-B3，pcDNA3.1-GapC-C3d3和pcDNA3.1-B3-C3d3。 對DNA 疫苗的初步免疫效果檢測發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1-Gap

4、C,pcDNA3.1-GapC-C3d3，pcDNA3.1-B3，pcDNA3.1-B3-C3d3可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，抗體最高效價分別為1:400，1:3200，1:100，1:100。pcDNA3.1-B3、pcDNA3.1-GapC和pcDNA3.1-GapC-C3d3可以引發(fā)細胞免疫反應(yīng)，刺激指數(shù)分別為1.590±0.031，1.406±0.366，1.332±0.132。pcDNA3.1-GapC-C3d3抗體最高效價

5、為pcDNA3.1-GapC的4倍，證實牛C3d3可以顯著增強抗原在小鼠體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答。 在獲得GapC基因和B3片段基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了重組原核表達載體pET32-GapC和pET32-B3。重組蛋白抗原Trx-GaoC和Trx-B3通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得了高表達，其蛋白含量分別達到全菌蛋白的80％和90％以上。通過Ni<'2+>螯合親和色譜建立了高效的純化方法，Trx-GapC和Trx-B3純度分別達到95％和99％。重