肺炎鏈球菌蛋白（LytA）疫苗的制備及其相關(guān)臨床前期基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究背景與目的：肺炎鏈球菌是一種較為常見的革蘭氏陽(yáng)性致病菌，約40﹪～50﹪健康人群攜帶有肺炎鏈球菌。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，如麻疹等呼吸道病毒感染以后，營(yíng)養(yǎng)不良或者老年體弱等情況下，肺炎鏈球菌將透過(guò)粘膜防御體系，從粘附部位下行至肺或者進(jìn)入血液引起細(xì)菌性肺炎，以及中耳炎、菌血癥、腦膜炎等相關(guān)疾病。在英國(guó)，40﹪～50﹪的社區(qū)獲得性肺炎(community acquire pneumonia，CAP)以及20﹪的腦膜炎由它引起的。在美國(guó)，致命

2、性的肺炎鏈球菌感染病例每年約有40000例。由肺炎鏈球菌所引起的社區(qū)獲得性肺炎有著較高的死亡率，在不同的發(fā)達(dá)國(guó)家這一比例平均達(dá)到20﹪～50﹪左右，30﹪～60﹪幸存者都有不同程度的長(zhǎng)期后遺癥，包括聽力喪失，神經(jīng)缺陷，以及神經(jīng)心理?yè)p傷。在我國(guó)，肺炎鏈球菌感染致病人群主要為兒童。一項(xiàng)對(duì)北京地區(qū)307名兒童咽試子細(xì)菌培養(yǎng)調(diào)查顯示，健康兒童中肺炎鏈球菌的平均帶菌率為18.6﹪，居各細(xì)菌之首。對(duì)各年齡組分別統(tǒng)計(jì)顯示，1～3歲組兒章帶菌率最高，為

3、29.5﹪；4～6歲組為18．7﹪；7～9歲組為8.62﹪；10～13.56﹪。隨著目前耐萬(wàn)古霉素肺炎鏈球菌菌株的發(fā)現(xiàn)，更意味著抵抗該菌感染最后一道防線的喪失。而目前市場(chǎng)上廣為使用的莢膜多糖疫苗以及結(jié)合疫苗由于其固有的局限性，使得預(yù)防肺炎鏈球菌感染，特別是對(duì)高危人群(60歲以上的老人和5歲以下的幼兒)感染的預(yù)防變得更為困難。發(fā)展新一代蛋白質(zhì)疫苗以及抗原表位亞單位疫苗已經(jīng)成為必然而迫切的實(shí)際需要。 研究結(jié)果 一、按照《生物

4、制品規(guī)程》、《新生物制品審批辦法》以及中國(guó)發(fā)明專利申報(bào)相關(guān)要求，完成了肺炎鏈球菌LytA重組蛋白疫苗的制備及鑒定工作。 (1)擴(kuò)增了兩端帶有完整酶切位點(diǎn)的LytA編碼基因片段，測(cè)序表明與構(gòu)建的序列與理論序列完全一致。 (2)完成了宿主菌和工程菌大體菌落形態(tài)、低倍鏡下觀、高倍鏡下觀、電鏡下觀察、藥敏反應(yīng)、生化反應(yīng)等鑒定為生物制品申報(bào)以及專利申請(qǐng)?zhí)峁┝吮仨毜幕緦?shí)驗(yàn)室研究資料。電鏡觀察表明，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的工程菌不具有菌毛和鞭

5、毛，為非致病性大腸桿菌。 (3)在誘導(dǎo)過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的LytA重組質(zhì)粒具有良好的穩(wěn)定性，均在96﹪以上。 (4)將傳代后的第50、40、30、20、10代工程菌與原始種子工程菌進(jìn)行生物化學(xué)與藥物敏感測(cè)定。結(jié)果經(jīng)對(duì)比分析后表明，多次無(wú)抗生素選擇壓力條件下培養(yǎng)傳代后其生物化學(xué)反應(yīng)以及耐藥譜均沒有發(fā)生改變。 (5)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的用于表達(dá)LytA的工程茵在pH為7.0的LB培養(yǎng)基、37℃、轉(zhuǎn)速為250rpm的條件

6、下?lián)u瓶培養(yǎng)1.5小時(shí)后即達(dá)到快速生長(zhǎng)中期。 (6)在LB、SOB、TB、XY等不同培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)表達(dá)自溶酶融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LB培養(yǎng)后目的蛋白在全菌蛋白中的表達(dá)量所占比例最大。 (7)誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，加入IPTG誘導(dǎo)后，LytA在25℃或者37℃的條件下有較高比例的表達(dá)，在25℃時(shí)表達(dá)比例較高一些，并且包涵體形成很少，主要以可溶性表達(dá)為主。 (8)在誘導(dǎo)表達(dá)中，當(dāng)LB培養(yǎng)液的pH值處于6.8～7.0左右時(shí)，目

7、的蛋白有較高比例的表達(dá)。 (9)接種量在1﹪、5﹪、10﹪時(shí)其表達(dá)比例均較高，三者之間差別不大，考慮到純化表達(dá)過(guò)程中成本優(yōu)化問(wèn)題，確定1﹪的接種量為最佳接種量。 (10)隨著裝液量的增加，蛋白表達(dá)的絕對(duì)量也呈增加趨勢(shì)，但是在40﹪的裝液量時(shí)其蛋白的表達(dá)比例最高。 (11)在25℃低溫誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h、10h后蛋白均有較為大量的表達(dá)，并且表達(dá)百分比趨于一致。為簡(jiǎn)化表達(dá)純化工藝流程，降低成本，選

8、擇2h～4h為純化表達(dá)工藝中最佳誘導(dǎo)時(shí)間。 (12)綜合LytA表達(dá)純化過(guò)程中各種優(yōu)化條件的分析，確定了LytA表達(dá)的穩(wěn)定與最優(yōu)化體系，采用凝膠色譜、大孔徑碳柱分析，分析方法用HPLC面積歸一化法，測(cè)得蛋白疫苗混合組分中LytA主含量所占比例為95.7﹪。 (13)等電聚膠分析，測(cè)定LytA的實(shí)際PI為5.0。 (14)LytA氨基酸組成分析：對(duì)照理論百分比組成(來(lái)自于NCBI查詢結(jié)果)，發(fā)現(xiàn)實(shí)際含量最高者為As

9、p，最低者為Cys。除Asp、Thr、Glu、Gl y、Val、Leu、Arg外，其他基本相符，而差異最大的是Asp、Val這兩種氨基酸。 二、LytA重組蛋白疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生呼吸道粘膜sIgA的產(chǎn)生，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其安全性符合《新生物制品審批辦法》中相關(guān)要求。 (1)LytA進(jìn)行初步的毒性安全實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)免疫后觀察七天，動(dòng)物健存，體重增加，注射處無(wú)紅種，無(wú)結(jié)痂。 (2)與多糖疫苗免疫過(guò)的小鼠以及正常對(duì)照小鼠相比，

10、運(yùn)用重組的LytA蛋白免疫后的小鼠，其血清中IgG、IgA抗體水平均特異性升高，sIgA在肺、鼻咽灌沈液中有較高水平，而在肺灌洗液中更高一些。 (3)經(jīng)肺組織大體觀察、病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)自溶酶蛋白免疫能為5種不同血清型(6B、6A、19F、23F、14)的肺炎鏈球菌感染的小鼠提供較好的免疫保護(hù)力。自溶酶蛋白免疫對(duì)19F血清型肺炎鏈球菌攻擊感染后小鼠的保護(hù)性很好，小鼠存活率達(dá)到80﹪。對(duì)23F、6B血清型肺炎鏈球菌攻擊感染后小鼠

11、的保護(hù)性較好，小鼠存活率達(dá)到60﹪。而對(duì)照組存活率僅為30﹪。FITC熒光標(biāo)記抗體定位分析結(jié)果表明，LytA免疫后，在小鼠氣管粘膜表面、肺泡表面有、sIgA分布。為自溶酶蛋白免疫能誘導(dǎo)先天性免疫保護(hù)效應(yīng)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 三、成功預(yù)測(cè)并克隆構(gòu)建了含有多表位抗原基因的重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了多表位抗原的成功表達(dá)，純化的抗原蛋白分子量為5kDa。 (1)綜合多種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具的分析選定序列2～28(EINVSKLRTDLPQ

12、VGVQPYRQVHAHST)為可能的B細(xì)胞抗原表位，序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)為可能的T細(xì)胞抗原表位。并且預(yù)測(cè)的MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽序列與預(yù)測(cè)的B細(xì)胞抗原表位序列是重疊的。 (2)不同血清型肺炎鏈球菌LytA的抗原表位分布并不存在差異。 (3)重組表達(dá)載體的篩選和鑒定結(jié)果表明目的基因序列沒有發(fā)生移碼突變，重組表位的實(shí)際基因序列與理論設(shè)計(jì)完全一致。 (4)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-1<

13、,1>1<,2>誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳顯示，在沉淀樣品中出現(xiàn)一大小約為31kDa較粗的蛋白條帶，這是GST和插入其下游的5kDa的重組抗原表位L<,1>L<,2>所形成的融合蛋白。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載pGEX-4T-1大腸桿菌在26 kDa處出現(xiàn)一明顯條帶，為空載體誘導(dǎo)后所表達(dá)的GS7。蛋白。 小結(jié)按照《生物制品規(guī)程》、《新生物制品審批辦法》和中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)要求，我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室pGEX-4T-1質(zhì)粒、所構(gòu)建的LytA表達(dá)重

14、組質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行了鑒定。對(duì)宿主菌和工程菌的穩(wěn)定性、耐藥性、生化反應(yīng)特性等進(jìn)行了鑒定分析，并對(duì)LytA的相關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)行了鑒定。對(duì)LytA的保護(hù)性進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。結(jié)果顯示所構(gòu)建的重組質(zhì)粒、工程菌菌具有較高的穩(wěn)定性，適合運(yùn)用于規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)，建立的LytA重組表達(dá)體系具有穩(wěn)定性、高效性的特點(diǎn)。本研究基本完成了肺炎鏈球菌LytA重組蛋白疫苗的臨床前期研究工作，有關(guān)內(nèi)容已經(jīng)申報(bào)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)枺?00710027897.7)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明