A族鏈球菌多介表位疫苗的完善制備及其動物免疫保護作用的相關研究.pdf

1、目的:A族鏈球菌(groupA streptococcus，GAS)是一種常見的革蘭氏陽性菌，可以引起多種侵襲性感染和自身免疫性疾病。在大多數(shù)發(fā)展中國家GAS感染導致的風濕熱、風濕性心臟病、腎小球腎炎等仍然是嚴重威脅人們生活質量的一大問題。而對于GAS感染的治療目前大多為青霉素、大環(huán)內酯類藥物或靜脈注射免疫球蛋白，但由于耐藥性或保護作用短暫等原因致使GAS感染仍舊保持著很高的復發(fā)率。所以制備成功有效的GAS疫苗成為GAS預防和治療的研究

2、熱點。
　　本室前期已構建了包含7個FbaA表位和M蛋白1、3、6、18血清型的與人無交叉反應的部分基因及M蛋白的C端共同基序（J基因）的pET28a/F7M5[1]，但是根據(jù)近期新的流行病學調查顯示，我國大部分地區(qū)GAS流行菌株中M12血清型占了一大部分。故本實驗在本室構建好的質粒的外源基因序列上插入M12與人無交叉反應的基因片段并表達，該蛋白命名為F7M6，又以其為模板構建表達了只含有6個不同M蛋白血清型的基因片段，該蛋白命名

3、為M6。將F7M6蛋白，M6蛋白和本室保存的M1全長蛋白（簡稱M蛋白）分別免疫小鼠，通過ELISPOT、ELISA等實驗技術觀察細胞免疫和體液免疫效果，并攻毒后計算存活率，以確定疫苗保護效果。
　　方法:
　　1利用生物信息學方法在美國疾病預防和控制中心(CDC)數(shù)據(jù)庫獲GAS M12血清型的基因序列，通過與人體組織基因比對選取與人無交叉反應的特異性序列，采用搭橋PCR的方法擴增并插入F7M5序列中，得到F7M6序列。

4、>　　2在線預測F7M6序列表位。
　　3在線預測F7M6蛋白空間結構和親水性分析。
　　4以F7M6序列為模板，PCR擴增出含有M蛋白1、3、6、18、12血清型和M蛋白C端共同基序（J基因）的基因序列，得到M6序列。
　　5將兩段基因片段克隆至載體pET28a中，測序正確后將陽性質粒分別轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，SDS-PAGE電泳觀察結果，Western blot鑒定。采用親和層析純化方法對兩種

5、蛋白進行純化。
　　6將純化的兩種蛋白，連同本室保存的GAS M蛋白，以相同劑量聯(lián)合佐劑分別免疫小鼠，腹部皮下多點注射，同時設立PBS對照組。每組12只，20μg/每只;免疫間隔21天，共免疫4次;于每次免疫10天后下頜竇靜脈取血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　7末次免疫后10天，處死6只小鼠，ELISPOT檢測小鼠脾臟免疫細胞表達IL-4和IFN-γ的水平，ELISA檢測各組血清中IgG、IgG1、IgG2a的水平及動

6、態(tài)變化。
　　8用ELISA法檢測臨床獲取的抗鏈“O”陽性和健康兒童血清與F7M6蛋白的特異性結合能力。
　　9采用全菌ELIAS法，檢測臨床獲取的GAS菌株與F7M6組血清的結合能力。
　　10用致死量的M1GAS腹腔攻擊各組剩余下的6只小鼠，觀察并計算各組存活率。
　　結果:
　　1成功構建了pET28a/F7M6、pET28a/M6陽性質粒，并成功表達蛋白。Western blot結果顯示兩種蛋白均可

7、以與F7M5抗體雜交。
　　2 ELISA檢測各組血清，結果顯示，隨免疫次數(shù)增加，IgG水平逐漸增高，F(xiàn)7M6組效價達到1∶669309，M6組效價達到1∶58158，M蛋白組達到1∶32980，。F7M6組顯著高于M6組和M蛋白組(P＜0.001)，但M6組和M蛋白組間無統(tǒng)計學差異。
　　3血清IgG1和IgG2a檢測結果顯示，三組均可誘導較高水平的相應抗體，均顯著高于PBS組(P＜0.001)，IgG1各組間沒有顯著差異

8、，IgG2a水平則F7M6組顯著高于M6組(P=0.009)，但F7M6組與M蛋白組、M6與M蛋白組間沒有差異。
　　4 ELISPOT結果顯示，IL-4，IFN-γ水平:F7M6、M6和M蛋白組均顯著高于PBS組(P＜0.001)，且F7M6組的水平最高，而M蛋白組高于M6組(P＜0.05)。
　　5用F7M6蛋白作為診斷抗原檢測抗鏈“O”陽性的病人血清及健康人血清，結果顯示，抗鏈“O”陽性的病人血清，陽性檢出率為(95％

9、)，而健康兒童血清的陽性率為(47.3％)，二者差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.005)。
　　6 ELISA檢測4株臨床株于不同組的血清的結合能力，結果顯示F7M6均能與其結合。
　　7攻毒后，F(xiàn)7M6、M6和M蛋白各組生存率分別為66.7％、33.3％和66.7％，PBS組全部死亡。統(tǒng)計分析顯示各實驗組均高于PBS組(P＜0.05)。
　　結論:
　　1成功構建并表達F7M6和M6蛋白。
　　2 F7M6、