A族鏈球菌表面蛋白Fba單克隆抗體的制備及其結(jié)合表位的初步定位.pdf

1、目的：A族溶血性鏈球菌(GAS)是咽部、皮膚、軟組織感染的常見致病菌，也是引起兒童中毒性疾病猩紅熱、毒性休克綜合征等的病原，它的危害還在于可以導(dǎo)致感染后的自身免疫性疾病風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、腎小球腎炎、牛皮癬以及免疫性腦病等。由于耐藥菌株的出現(xiàn)及鏈球菌本身的免疫逃逸，臨床上鏈球菌感染仍然存在著反復(fù)性及難以治愈等問題，疫苗有望成為控制鏈球菌感染的最有效措施。盡管研究鏈球菌疫苗的歷史可以追溯至四十年前，但各種原因?qū)е履壳叭詻]有理想的疫苗問世

2、。M蛋白由于血清型眾多及其與人的心臟、腎臟等發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，因此其應(yīng)用受到限制。除此以外，尋求非M蛋白疫苗的腳步也沒有停止。世界各地不同實(shí)驗(yàn)室的研究涉及到鏈球菌的F1蛋白、Sse蛋白、C5肽酶、鏈球菌糖、外毒素等，但免疫效果始終難以超越M蛋白，因此非M蛋白與M蛋白的聯(lián)合構(gòu)建也是一種趨勢(shì)。 Fba蛋白(Fibronectin-binding protein a)是2001年由Terao等發(fā)現(xiàn)的一種新的鏈球菌表面蛋白，它與金黃色葡

3、萄球菌Fn結(jié)合蛋白(FnBPA)同源性高達(dá)69％，其基因被定為Spy2009。經(jīng)測(cè)定該基因含有1068個(gè)核苷酸，編碼355個(gè)氨基酸，分子量為37.8Kda。整個(gè)肽鏈從N端分為信號(hào)肽區(qū)，雙螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，富含脯氨酸區(qū)及C端的錨定區(qū)。它存在于鏈球菌的M1、2、4、9、13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等多個(gè)血清型中，各型之間的Fba蛋白差異不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)Fba蛋白的GAS(Fba+GAS)

4、侵入上皮細(xì)胞的能力較強(qiáng)。它還可以結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白FH和FHL-1，并可能借此逃避補(bǔ)體攻擊、抵抗巨噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬。本室前期研究發(fā)現(xiàn)Fba蛋白可誘發(fā)與M蛋白相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答，因此Fba蛋白具備作為GAS疫苗候選蛋白的極其有利的潛質(zhì)。本研究旨在研制抗Fba蛋白的單克隆抗體，根據(jù)Fba蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分段克隆表達(dá)，并對(duì)獲得的單克隆抗體結(jié)合區(qū)域進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步研究Fba蛋白功能及研制其表位肽疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.將

5、GST-Fba重組蛋白聯(lián)合佐劑免疫雌性BALB/c小鼠。以GST-Fba重組蛋白為包被抗原，采用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠抗血清效價(jià)。取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽性克隆，有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗A族鏈球菌表面Fba蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，接種小鼠腹腔制備腹水。 2.鑒定單克隆抗體。以重組的GST-Fba蛋白為抗原包被，采用間接ELISA法測(cè)定腹水

6、及上清單克隆抗體效價(jià)，免疫印跡分析單克隆抗體特異性，采用全菌ELISA鑒定單克隆抗體的抗原表位是否為位于菌體表面的天然表位。 3.根據(jù)Fba蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將其劃分為四個(gè)重疊區(qū)域，劃分結(jié)果為：37～110aa、68～161aa、104～277aa、160～324aa。 分別命名為FbaA1、FbaA2、FbaA3、FbaA4。 4 PCR方法擴(kuò)增分段fba基因，PCR產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T，測(cè)序正確后

7、將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)分段重組蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果，Western-blotting鑒定。親和層析柱純化重組蛋白。 5免疫印跡法、ELISA法鑒定單克隆抗體與四段蛋白的結(jié)合區(qū)段。 6在線預(yù)測(cè)Fba蛋白的B細(xì)胞表位。 結(jié)果： 1經(jīng)3次亞克隆后獲得兩株穩(wěn)定分泌抗GST-Fba融合蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。分別命名為1號(hào)單抗、

8、2號(hào)單抗。融合率為37.1％，GST和GST-Fba蛋白雙篩陽性克隆率為2％。 2雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體最高效價(jià)達(dá)1:640，腹水抗體最高效價(jià)達(dá)1:105。免疫印跡法顯示單克隆抗體與GST-Fba融合蛋白有特異性反應(yīng)帶，與GST則未見有反應(yīng)條帶。全菌ELISA結(jié)果顯示所得的l號(hào)單抗和Fba+及Fba-菌的結(jié)合力無明顯的區(qū)別，說明此單抗所針對(duì)的表位不位于菌體表面，或并非Fba蛋白的天然表位，也可能與非Fba蛋白存在著交叉反應(yīng)。2號(hào)

9、單抗顯示其可以特異的結(jié)合Fba+菌，和Fba-菌的結(jié)合能力極弱，表明2號(hào)單抗結(jié)合的表位為位于菌體表面的Fba特異的天然線性表位。 3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約242bp、302bp、540bp、512bp與理論值相附。 4表達(dá)的重組菌經(jīng)SDS-PAGE分析出現(xiàn)四條強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)帶，未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌此處的蛋白帶較弱。免疫印跡分析顯示表達(dá)的該重組蛋白能被抗GST的單克隆抗體識(shí)別，說明重組菌表達(dá)了Fba的分段融合蛋白。 5單

10、抗與表達(dá)的四段蛋白的免疫印跡法鑒定結(jié)果顯示1號(hào)單抗結(jié)合FbaA3及FbaA4段，2號(hào)單抗僅僅結(jié)合FbaA2段。ELISA法結(jié)果顯示與免疫印跡法鑒定結(jié)果相一致。2號(hào)單抗僅結(jié)合FbaA2段，與FbaA1及FbaA3段不結(jié)合，其結(jié)合的表位可能位于104-110aa左右。 6實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在線預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位結(jié)果相符。 結(jié)論： 1本研究通過常規(guī)細(xì)胞融合，成功篩選出2株針對(duì)Fba蛋白雜交瘤細(xì)胞株，并證明了該單抗的生物學(xué)活性，為深