A族鏈球菌表面蛋白Fba單克隆抗體對(duì)應(yīng)表位的鑒定及研究.pdf

1、目的：A族鏈球菌（GAS）是一種常見致病菌，可引起嚴(yán)重的侵襲性感染及感染后變態(tài)反應(yīng)性疾病。青霉素一直是抗鏈球菌感染的首選藥物，但隨著抗菌藥的大量應(yīng)用、乃至濫用，耐藥菌株逐漸增多，加之鏈球菌本身的免疫逃逸，鏈球菌感染在臨床上仍然呈現(xiàn)反復(fù)性及難以治愈的問題。誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)抗體仍然是預(yù)防、控制鏈球菌感染的有效措施，故疫苗的研制成為預(yù)防此菌感染的又一切入點(diǎn)。但由于GAS血清型眾多及其表面某些免疫原性強(qiáng)的蛋白可誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)等弊端，目前還

2、沒有理想的疫苗問世。本研究以McAb2結(jié)合Fba蛋白的特異性區(qū)段為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測McAb2所對(duì)應(yīng)的表位，借助基因工程手段獲取了含有相應(yīng)表位的融合蛋白及預(yù)期表位缺失蛋白，并利用噬菌體肽庫篩選McAb2結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)該結(jié)合位點(diǎn)是否與FH和Fba蛋白的結(jié)合位點(diǎn)相重疊進(jìn)行了研究。為進(jìn)一步探索Fba蛋白在GAS致病機(jī)制中的作用，鑒定McAb2的功能及制備表位肽疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴針對(duì)McAb2結(jié)合Fba蛋

3、白的特異區(qū)段，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其所對(duì)應(yīng)的表位，確定涵蓋此表位的三個(gè)重疊表位片段，采用搭橋PCR擴(kuò)增該基因片段并克隆表達(dá)，Western blot檢測融合蛋白與McAb2的結(jié)合。⑵構(gòu)建相應(yīng)表位缺失的基因片段并克隆表達(dá)，Westernblot及ELISA檢測突變蛋白與McAb2是否結(jié)合。⑶合成表位重疊肽片段，dot-ELISA檢測各段與McAb2的結(jié)合。⑷利用噬菌體7肽庫篩選McAb2對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢氨基酸。⑸通過競爭ELISA檢測McAb

4、2是否能競爭FH與Fba蛋白的結(jié)合。⑹利用血漿吸附實(shí)驗(yàn)[5]檢測McAb2能否阻止人血漿中的FH與Fba蛋白結(jié)合。
　　 結(jié)果：①成功構(gòu)建了pGEX-4T-2與預(yù)測的三條基因片段84～101aa、95～114aa、101～118aa的原核表達(dá)質(zhì)粒，并分別得以表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)ba95-114和Fba101-118與McAb2有明顯的雜交帶。②成功構(gòu)建表位缺失的基因片段68～161aa△96～118aa與p

5、GEX-4T-2的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并得以成功表達(dá)。Western blot顯示McAb2不與Fba68-161△96-118結(jié)合。間接ELISA結(jié)果與上述結(jié)果一致。③合成三段重疊肽分別是Fba蛋白的第100～112、104～116和108～120位氨基酸多肽，dot-ELISA結(jié)果顯示第100～112位的氨基酸多肽與McAb2的結(jié)合能力最強(qiáng)。④利用隨機(jī)噬菌體7肽庫篩選的結(jié)果顯示McAb2針對(duì)的優(yōu)勢氨基酸是位于Fba基因序列的第100～

6、110位氨基酸中的ITPDL。⑤競爭EIASA數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，證實(shí)McAb2能部分封閉FH與野生型GAS的結(jié)合。⑥血漿吸附實(shí)驗(yàn)證實(shí)野生型GAS能結(jié)合人血漿中的FH，并且McAb2可以部分阻止FH與Fba蛋白的結(jié)合。
　　 結(jié)論：⑴成功克隆、表達(dá)了Fba蛋白McAb2所對(duì)應(yīng)的表位肽段及預(yù)期表位缺失蛋白，初步確定了McAb2對(duì)應(yīng)的表位區(qū)段。⑵利用噬菌體展示技術(shù)，確定了McAb2所針對(duì)的優(yōu)勢氨基酸。⑶McAb2能夠阻止或部分阻止FH