a族鏈球菌pcdna3.1spy0747基因疫苗的制備及免疫效果分析

1、；．- - I ：I L 醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師( 或指導(dǎo)小組) 的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲得的研究成果，其知識產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名為單位河北醫(yī)科大學(xué)，試驗材料、原始數(shù)據(jù)、申報的專利等知識產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)法律責(zé)任。研究生簽名：弓粕色導(dǎo)師簽章： 二級學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)蓋章≥嘶

2、≯0 乃，r 年，7 月 ／ ．1 ，， ‘ ／U ，．J ● 1 ，J 砍V 陶曠‘。河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝等內(nèi)容外，文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名：穢池 導(dǎo)師簽章：墨弋％分 導(dǎo)師簽章： 麥弋孤擴(kuò)洲廠年／1 月均日中文摘要A 族鏈球菌p c D N A 3 ．1 ／S

3、 p y 0 7 4 7 基因疫苗的制備及免疫效果分析摘 要目的：A 族鏈球菌( G r o u p A s t r e p t o c o c c u s ，G A S ) ，是- I 中人類特異性致病菌，又稱化膿性鏈球菌，它通過飛沐、皮膚接觸傳播，在全球分布廣泛。G A S 既能引起咽喉炎、膿皰病等較輕的感染，也能引起風(fēng)濕性心臟病、關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎等后遺癥，還會導(dǎo)致敗血癥、鏈球菌中毒休克綜合癥等嚴(yán)重疾病。皮膚和上呼吸道是G A S

4、 最常寄居的部位，> 2 0 ％兒童是無癥狀帶菌者，全球每年大約有5 0 萬人死于鏈球菌感染性疾病。雖然鏈球菌仍然對抗生素敏感，但耐藥的報道也在不斷增加。因此，近‘百年來人們一直在尋找能有效預(yù)防鏈球菌的疫莆，但很遺憾，目前仍然沒有一個安全有效的疫苗用于臨床。近年來，人們應(yīng)用互補(bǔ)基因組技術(shù)在G A S表面篩選了一些細(xì)菌表面抗原，有些已經(jīng)通過動物實(shí)驗驗證有一定的免疫保護(hù)作用。S p y 0 7 4 7 是鏈球菌表面的一種D N A 酶

5、，因為它和豬鏈球菌表面D N A 酶S s n A 具有同源性，并且其活性的發(fā)揮都需要C a 2 + 和M g ’2 + ，所以S p y 0 7 4 7 又被稱為S p n A 。S p n A 在目前已知的鏈球菌種群中有很廣泛的分布，它能誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，在核酸實(shí)驗中，這些抗體能夠抑制S p n A 的活性，并且S p n A 的基因突變?nèi)笔途甑亩玖γ黠@F 降，這說明S p n A 具有丌發(fā)疫苗的潛力。本研究擴(kuò)增了S p n

6、A 蛋白的編碼基因，并連接到真核表達(dá)質(zhì)粒上制成核酸疫苗，通過動物實(shí)驗來驗證該疫苗的有效性i 。方法： ( 1 ) 引物設(shè)計：本實(shí)驗的日的基兇為S p y 0 7 4 7 基區(qū)I ，其引物用p r i m e r p r e m i e r5 ．0 軟件進(jìn)行設(shè)計，經(jīng)P C R 方法擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化。 ( 2 ) P G E M —T ／S p y 0 7 4 7 構(gòu)建：P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物與P G E M —T v e

7、c t o r 連接，轉(zhuǎn)化基兇工程菌E ．c o l iD H 5 Q ，并構(gòu)建克隆載體，在設(shè)計的酶切位點(diǎn)處用B a m HI 、X h oI 雙酶切并電泳鑒定，之后測序鑒定。 ( 3 ) p c D N A 3 ．1 ／S p y 0 7 4 7 構(gòu)建：回收克隆載體上S p y 0 7 4 7 的片段，連接于p c D N A 3 ．1 載體，它們預(yù)先經(jīng)同樣的酶切回收。構(gòu)建的暈組質(zhì)粒為真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后一2 0 。C 保存待用。(