羅非魚海豚鏈球菌疫苗研制及胞外產(chǎn)物特性分析.pdf

1、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)病是水生動物的一種重要細(xì)菌性疾病,可感染多種海水和淡水魚類,在世界許多國家均有該病的暴發(fā)和流行,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害。近年來我國海豚鏈球菌病也頻頻爆發(fā),目前已經(jīng)感染了牙鲆、羅非魚、美國紅魚等。
　　 本實(shí)驗(yàn)從患病的羅非魚體內(nèi)經(jīng)分離純化得到一菌株,通過Biolog以及16SrRNA基因PCR鑒定該菌為海豚鏈球菌,并對羅非魚進(jìn)行了致病性實(shí)驗(yàn),得出海豚鏈球菌對羅非魚的半致死量為

2、6.81×107cfu/mL。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對四環(huán)素、青霉素G、環(huán)丙沙星、新生霉素、頭孢呋肟、呋喃妥因、氧哌嗪青霉素、強(qiáng)力霉素等較為敏感,而對新霉素、卡那霉素不敏感。
　　 由于該菌對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求極高,同時(shí)為以后疫苗基礎(chǔ)作準(zhǔn)備,本實(shí)驗(yàn)對海豚鏈球菌的培養(yǎng)進(jìn)行了優(yōu)化研究,主要優(yōu)化了液體培養(yǎng)基BHI的條件,得出海豚鏈球菌的培養(yǎng)基最適pH為7～8,最適培養(yǎng)溫度為30℃,振蕩培養(yǎng)對海豚鏈球菌的生長影響不明顯。培養(yǎng)基優(yōu)化研究表明,在

3、BHI培養(yǎng)基中添加10 mg/mL的酵母粉和2 mg/mL的葡萄糖即可在對數(shù)期獲得最大細(xì)菌量。同時(shí)也得出海豚鏈球菌的生長曲線,即:0～4 h為生長延遲期,4～24h為對數(shù)生長期,24～48 h為穩(wěn)定期,隨后進(jìn)入衰亡期。
　　 通過瓊脂平板擴(kuò)散法、酪蛋白底物法研究了海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物(ECP)的一些理化特性以及化學(xué)試劑對胞外產(chǎn)物酶(ECPase)的影響,將海豚鏈球菌ECP注射到羅非魚體中檢驗(yàn)其致病性,通過一維和雙向電泳技術(shù)分析胞外

4、產(chǎn)物蛋白點(diǎn),并自制了鼠抗海豚鏈球菌用其對海豚鏈球菌胞外產(chǎn)物的免疫原性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示海豚鏈球菌ECP具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶、明膠酶、脂肪酶以及溶血的活性,但不具有脲酶活性。EDTA、DTT、PMSF可以使ECPase的活性下降至72.4％、77.6％、72.4％,而Cu2+、Ca2+、K+、Mg+對ECPase的活性有抑制作用,Co2+、Fe3+、Mn2+對其有一定程度的激活作用；ECPase對熱穩(wěn)定性較好,堿性條件下活性較高,

5、其最適溫度為55℃。經(jīng)腹腔注射感染羅非魚,發(fā)現(xiàn)對羅非魚有致病性,且隨ECP濃度的升高羅非魚的死亡率也升高。在SDS-PAGE圖中可發(fā)現(xiàn)ECP主要有12條條帶,主要集中在28-68kDa之間,在雙向電泳圖中,海豚鏈球菌的ECP主要條帶集中在26-95kDa之間,海豚鏈球菌在pH為4-7時(shí)有120個(gè)點(diǎn)。western-blot結(jié)果主要得出4條免疫條帶,分子量分別為26kDa、37kDa、95 kDa、97 kDa。
　　 同時(shí)研制了

6、海豚鏈球菌福爾馬林滅活疫苗以及白油佐劑疫苗,并用這兩種疫苗分別腹腔注射羅非魚(80g/100g),每尾注射0.2mL,對照組注射無菌生理鹽水,結(jié)果顯示各免疫組對羅非魚的溶菌酶活性、SOD活力、血清抗菌活力以及血清抗體效價(jià)水平均顯著高于對照組。免疫八周后腹腔注射海豚鏈球菌菌液2x108cfu/ml的劑量,觀察15天后得出水劑組的相對保護(hù)率為65.43％,而油劑組的相對保護(hù)率為88.89％,表明這兩種疫苗均有助于羅非魚抵抗海豚鏈球菌的能力。