海豚鏈球菌高效拮抗菌的篩選、特性分析及其生態(tài)效應(yīng)的研究.pdf

1、海豚鏈球菌是羅非魚(yú)鏈球菌病的主要病原菌之一,其所引發(fā)的鏈球菌病近年來(lái)給羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失。養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化是導(dǎo)致羅非魚(yú)鏈球菌病害加劇的主要原因之一。該病目前主要依靠化學(xué)藥物進(jìn)行防治,雖在短時(shí)間內(nèi)有一定的效果,但同時(shí)存有種種弊端。因此,從環(huán)境友好型水產(chǎn)養(yǎng)殖的角度出發(fā),尋找一種既能優(yōu)化養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境又能抑制海豚鏈球菌生長(zhǎng)繁殖的有效方法迫在眉睫。本文在分離自養(yǎng)殖水體環(huán)境的具有凈化水質(zhì)功能的多個(gè)菌株中進(jìn)行篩選,獲得了一株海豚鏈

2、球菌的高效拮抗菌——諾卡氏菌N0906。在此基礎(chǔ)上研究了諾卡氏菌N0906的生長(zhǎng)特性,拮抗功能、拮抗抑菌物質(zhì)的理化特性、規(guī)模化培養(yǎng)條件的優(yōu)化等,并對(duì)其在羅非魚(yú)鏈球菌病的生態(tài)預(yù)防上作了初步的應(yīng)用,以便為羅非魚(yú)鏈球菌病的生態(tài)防治提供理論參考。
　　 在試驗(yàn)室內(nèi)采用打孔法對(duì)分離自養(yǎng)殖水環(huán)境的具有凈化水質(zhì)功能的菌株進(jìn)行初篩,得到7株對(duì)海豚鏈球菌有明顯拮抗作用的菌株,它們分別是芽孢桿菌(B0903、B0910、B0916)、乳桿菌(L09

3、14、L0917)、假絲酵母(C0909)和諾卡氏菌(N0906)。通過(guò)研究這7株拮抗菌株的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、共凝集率、凈化水質(zhì)能力,從而進(jìn)一步篩選出高效拮抗菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明:7株菌株的生長(zhǎng)系數(shù)均大于海豚鏈球菌,L0917、C0909、N0906的倍增時(shí)間顯著低于海豚鏈球菌的倍增時(shí)間；其中只有L0914、C0909、N0906能與海豚鏈球菌產(chǎn)生共凝集作用,共凝集率分別為3.03％、4.11％、1.85％；7株菌都具有一定的凈化水質(zhì)的能力,但C

4、0909、L0914對(duì)氨氮的去除率顯著低于菌株N0906。綜上研究表明菌株N0906較適合作為海豚鏈球菌的拮抗菌株。
　　 以諾卡氏菌N0906為研究對(duì)象,通過(guò)測(cè)定菌體本身及其代謝產(chǎn)物對(duì)海豚鏈球菌的拮抗效能和拮抗抑菌物質(zhì)的活性來(lái)評(píng)價(jià)諾卡氏菌N0906的拮抗功能。結(jié)果表明,諾卡氏菌N0906在細(xì)胞生長(zhǎng)初期不具有抑制海豚鏈球菌的表征,細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期后期抑菌活性逐漸顯現(xiàn)并增強(qiáng),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期或衰亡期達(dá)到最大的抑菌活性；采用二倍

5、稀釋法測(cè)得諾卡氏菌N0906的抑菌活力為8AU/ml。抑菌物質(zhì)理化特性的研究結(jié)果表明,經(jīng)抽濾除菌的諾卡氏菌N0906培養(yǎng)濾液對(duì)蛋白酶K、胰蛋白酶敏感,具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性,光和貯藏穩(wěn)定性,水溶性較強(qiáng)、脂溶性較弱；在紫外吸收光譜下具有蛋白質(zhì)的特征吸收；經(jīng)40％硫酸銨提取的沉淀物具有抑菌活性、而去除沉淀的上清液無(wú)抑菌活性.這表明抑菌物質(zhì)是屬蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
　　 為了提高諾卡氏菌N0906抑菌物質(zhì)的產(chǎn)率,通過(guò)單因素試驗(yàn)和多因

6、素正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化,研究結(jié)果表明:該菌株的最佳培養(yǎng)基成分和配比為可溶性淀粉2.5％,(NH4)2SO40.5％,K2HPO40.085％,馬鈴薯浸出液20％。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)溫度、pH和菌齡對(duì)抑菌物質(zhì)的分泌合成影響顯著。諾卡氏菌N0906的最佳培養(yǎng)條件為:溫度32℃,pH值8.5,菌種菌齡12h,接種量4％,裝液量40％,搖瓶轉(zhuǎn)速150rpm。在此條件下,菌體培養(yǎng)濾液的抑菌活性最高,抑菌物質(zhì)的活性提高了25

7、.6％。
　　 將諾卡氏菌N0906加入羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體,對(duì)其生態(tài)防控海豚鏈球菌病害進(jìn)行了初步的研究,結(jié)果表明:(1)諾卡氏菌N0906對(duì)羅非魚(yú)安全無(wú)毒。經(jīng)不同濃度的諾卡氏菌N0906浸泡羅非魚(yú),試驗(yàn)組和對(duì)照組羅非魚(yú)均健康存活；(2)諾卡氏菌N0906可有效降低養(yǎng)殖水體中氨氮,亞硝酸鹽的含量。接種106CFU/ml諾卡氏菌N0906的試驗(yàn)組水體中氨氮、亞硝酸鹽含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),比對(duì)照組分別降低了85.51％和54

8、.38％,(3)諾卡氏菌N0906可增強(qiáng)魚(yú)體的免疫力。試驗(yàn)組羅非魚(yú)血清中溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、補(bǔ)體C3活力分別比對(duì)照組提高23.39％、39.19％、101.13％、65.16％；(4)諾卡氏菌N0906可有效拮抗海豚鏈球菌,降低鏈球菌病的發(fā)病率和死亡率.羅非魚(yú)養(yǎng)殖水體中海豚鏈球菌的數(shù)量由1.00×106CFU/ml降到2.95×104CFU/ml,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),羅非魚(yú)