嗜熱鏈球菌合成谷胱甘肽的生物特性研究.pdf

1、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是重要的工業(yè)菌種，與德式乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）或者瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）混合發(fā)酵生產(chǎn)酸奶或硬奶酪，是公認(rèn)的安全性菌株(Generally Recognized as Safe，GRAS)。然而，在現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)和產(chǎn)品運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程中，嗜熱鏈球菌要面對(duì)

2、各種生存壓力如細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧族引起的(Reactive Oxygen Species，ROS)氧脅迫，發(fā)酵產(chǎn)酸引起的酸脅迫，低溫運(yùn)輸、冷藏過程中溫度脅迫等，從而導(dǎo)致菌株生長緩慢、發(fā)酵能力減弱，直接影響產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和風(fēng)味，或縮短產(chǎn)品貨架期。因此，研究嗜熱鏈球菌脅迫抗性機(jī)制，提高其抵抗環(huán)境脅迫能力，對(duì)發(fā)酵劑制備和提高終產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。
　　谷胱甘肽(glutathione，GSH)是生物體內(nèi)重要的非蛋白巰基化合物，具有減

3、少自由基、維持胞內(nèi)還原環(huán)境、解毒、增強(qiáng)免疫力等重要作用。人們對(duì)GSH在真核細(xì)胞和革蘭氏陰性菌中的合成及功能做了較為透徹研究，在革蘭氏陽性細(xì)菌中報(bào)道較少。本論文主要圍繞嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑菌株的篩選，GSH的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、在菌株抵抗環(huán)境脅迫中的功能及GSH合成酶的克隆與表達(dá)等方面進(jìn)行研究，取得結(jié)果如下:
　　1.嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑菌株的篩選
　　本章在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中根據(jù)酸奶發(fā)酵劑的主要指標(biāo)，篩選到一株具有生產(chǎn)性能優(yōu)良的嗜熱鏈球菌菌株

4、，命名為S.thermophilus SDMCC18。該菌株的Leloir途徑酶活較高，能夠代謝利用半乳糖，生長速度快，產(chǎn)酸能力和產(chǎn)胞外多糖能力強(qiáng)。利用該菌株模擬酸奶發(fā)酵，凝乳時(shí)間為4小時(shí)30分鐘，酸度為92.49°T，脫水收縮性為70.2％，感官評(píng)價(jià)表明該菌株發(fā)酵的酸奶酸度適宜，口感細(xì)膩、粘稠且富有濃郁香味，是一株優(yōu)良的酸奶發(fā)酵劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.GSH在嗜熱鏈球菌中的合成及抗氧脅迫中的作用研究
　　嗜熱鏈球

5、菌為兼性厭氧且過氧化氯酶陰性菌株，然而該菌株能在有氧條件下生長和在低濃度H2O2條件下存活，表明其具有抵抗氧脅迫的能力，但抵抗氧脅迫機(jī)制有待闡明。本章圍繞嗜熱鏈球菌GSH合成能力和GSH在菌株抵抗氧脅迫中的作用展開研究。
　　首先，檢測(cè)40株分離自傳統(tǒng)酸奶的S.thermophilus在靜置和搖動(dòng)培養(yǎng)條件的生長能力和胞內(nèi)GSH含量，發(fā)現(xiàn)所有待測(cè)菌株均能在搖動(dòng)培養(yǎng)條件下生長并產(chǎn)生不同濃度的GSH，證明S.thermophilus具有

6、一定的抗氧脅迫能力，且胞內(nèi)GSH的積累與氧誘導(dǎo)無關(guān)，只具有菌株特異性。通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌基因組中存在編碼雙功能γ-谷氨酰半胱氨酸-谷胱甘肽合成酶(γ-GCS-GS)的基因gshF，通過gshF基因插入失活突變株S.thermophilus SDMCC18△gshF的構(gòu)建和胞內(nèi)GSH含量檢測(cè)，表明S.thermophilus編碼谷胱甘肽合成酶具有GSH合成活性。突變株S.thermophilus SDMCC18△gshF搖

7、動(dòng)培養(yǎng)及H2O2處理?xiàng)l件下的存活率較野生株比顯著降低，證明GSH能夠幫助S.thermophilus抵抗氧脅迫。此外，外源添加GSH能夠明顯促進(jìn)野生株和突變株的生長和存活率，證明S.thermophilus具有吸收外源的GSH并提高自身抵抗氧脅迫的能力，且胞內(nèi)GSH濃度的高低與菌株抵抗H2O2脅迫能力的正相關(guān)。本章實(shí)驗(yàn)首次證明嗜熱鏈球菌自身具有合成和轉(zhuǎn)運(yùn)GSH的能力，且通過以上兩種方式積累于細(xì)胞內(nèi)的GSH都賦予菌株抵抗氧脅迫能力。

8、>　　3.嗜熱鏈球菌菌株SDMCC18產(chǎn)生的GSH對(duì)酸脅迫的抵抗及對(duì)德式乳桿菌保加利亞亞種菌株ATCC11842的促進(jìn)作用
　　S.thermophilus和L.bulgaricus均屬于嗜中性菌(pH)。作為發(fā)酵劑菌株，產(chǎn)酸能力強(qiáng)、快速酸化原料能夠?yàn)榭s短發(fā)酵周期、節(jié)約生產(chǎn)成本提供有利條件，但是伴隨發(fā)酵進(jìn)程，有機(jī)酸積累，pH下降，酸脅迫對(duì)發(fā)酵劑自身的生長和存活產(chǎn)生不利影響。本章圍繞GSH對(duì)酸奶發(fā)酵劑菌株S.thermophilus

9、 SDMCC18和L.bulgaricus ATCC11842抵抗酸脅迫的保護(hù)作用開研究。
　　通過比較酸脅迫處理后野生株S.thermophilus SDMCC18和突變株S.thermophilus SDMCC18△gshF的存活率，發(fā)現(xiàn)野生株的活菌數(shù)是突變株的23.85倍，證明嗜熱鏈球菌自身合成的GSH具有保護(hù)菌株抵抗酸脅迫的作用。此外，外源添加GSH時(shí)，酸脅迫處理后野生株的存活率較不添加時(shí)提高425.53倍，表明嗜熱鏈球菌

10、在酸脅迫時(shí)能夠吸收外源GSH并大大提高其抵抗酸脅迫的能力。對(duì)于L.bulgaricus ATCC11842，通過檢測(cè)其胞內(nèi)的GSH含量表明該菌株不能合成GSH，但可以吸收外源GSH并促進(jìn)其生長和抵抗酸脅迫的能力。結(jié)合嗜熱鏈球菌能夠?qū)⒆陨砗铣傻腉SH分泌胞外，提出這兩個(gè)菌株有建立在GSH基礎(chǔ)上的協(xié)同作用關(guān)系并進(jìn)行證明。分別將突變株S.thermophilus SDMCC18△gshF和野生株S.thermophilus SDMCC18與L

11、.bulgaricus ATCC11842建立混合培養(yǎng)體系，結(jié)果表明L.bulgaricus ATCC11842的生長和存活率在與突變株的混合體系中都低于與野生株S.thermophilus SDMCC18的混合體系。然而，當(dāng)向突變株和L.bulgaricusATCC11842混和體系中外源添加GSH時(shí)，L.bulgaricus ATCC11842的生長和存活性能夠完全恢復(fù)到與野生株混合培養(yǎng)的水平，從而證明兩菌株有建立在GSH基礎(chǔ)上的相

12、互作用關(guān)系，而且S.thermophilus SDMCC18合成并分泌出的GSH有利于L.bulgaricus ATCC11842抵抗酸脅迫。最后，模擬酸奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明GSH具有縮短發(fā)酵時(shí)間、提高酸奶在冷藏時(shí)活菌數(shù)的作用，因此GSH可以作為一種優(yōu)良的添加劑，用以改善發(fā)酵劑生產(chǎn)性能，提高產(chǎn)品活菌數(shù)。以上結(jié)果首次證明GSH具有保護(hù)酸奶發(fā)酵劑菌株S.thermophilus和L.bulgaricus抵抗酸脅迫的作用，并建立了兩菌種基于GSH的

13、相互協(xié)同關(guān)系。
　　4.嗜熱鏈球菌GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的確定
　　GSH在乳酸菌中參與多種生理功能，但是只有少數(shù)乳酸菌具有合成和運(yùn)輸GSH的能力，且關(guān)于GSH轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還沒有詳細(xì)報(bào)道。本章在確認(rèn)嗜熱鏈球菌能夠從培養(yǎng)基中吸收且將自身合成GSH泵出胞外的基礎(chǔ)上，尋找GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，研究嗜熱鏈球菌的GSH轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。本章首先在已預(yù)測(cè)的S.thermophilus菌中3個(gè)假定GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建三個(gè)假定GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的插入失活突變株

14、。通過測(cè)定野生株和突變株胞內(nèi)、胞外GSH含量，發(fā)現(xiàn)野生株和突變株的胞內(nèi)、胞外GSH濃度基本相同，即假定GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的插入失活不會(huì)導(dǎo)致突變株攝取外源或泵出GSH能力丟失，證明預(yù)測(cè)的三個(gè)假定GSH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都不具備GSH轉(zhuǎn)運(yùn)功能。然后，根據(jù)比較基因組分析在S.thermophilus SDMCC18中定位一個(gè)二肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STND_0932和四個(gè)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:STND-0126、STND-0170、STND-1754和STND_1373。分別

15、構(gòu)建以上五個(gè)蛋白編碼基因的插入失活突變株，比較野生株和突變株的生長能力和胞內(nèi)GSH含量變化，發(fā)現(xiàn)STND_0170和STND_0932可能與S.thermophilus SDMCC18的GSH轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。利用熒光定量PCR檢測(cè)STND_0170和STND_0932基因在外源添加GSH時(shí)靜置和搖動(dòng)培養(yǎng)的表達(dá)差異，結(jié)果表明STND0932基因在靜置和搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)表達(dá)量均下調(diào)，而STND_0170基因在搖動(dòng)培養(yǎng)較靜置培養(yǎng)上調(diào)了6.5倍，基本確定S

16、TND_0170蛋白參與GSH轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　5.嗜熱鏈球菌雙功能GSH合成酶酶學(xué)性質(zhì)研究
　　嗜熱鏈球菌細(xì)胞合成一種新穎雙功能γ-谷氨酰半胱氨酸-谷胱甘肽合成酶(γ-GCS-GS，gshF)。該酶因其可連續(xù)催化GSH合成并不受γ-谷氨酰半胱氨酸中間產(chǎn)物和谷胱甘肽終產(chǎn)物的反饋抑制引起人們關(guān)注。目前，對(duì)γ-GCS-GS的研究多集中于利用其不受反饋抑制的性質(zhì)生產(chǎn)GSH，關(guān)于該酶的酶學(xué)性質(zhì)未見報(bào)道。
　　將S.thermophi