酸乳中嗜熱鏈球菌的分離及其海藻酸鈉包埋活性分析【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：酸乳中嗜熱鏈球菌的分離及其海藻酸鈉包埋活性分析</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品科學(xué)與工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) &

2、lt;/p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p>&l

3、t;p>　　本研究是從市售酸乳中分離出嗜熱鏈球菌，以藻酸鈉為包埋劑，對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行包埋。采用稀釋平板計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定乳酸中嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)，考察了海藻酸鈉，氯化鈣的濃度及凝膠珠的大小、保存時(shí)間對(duì)嗜熱鏈球菌包埋率的影響。結(jié)果顯示適宜的包埋工藝條件為海藻酸鈉濃度4%，氯化鈣濃度1.0%，凝膠珠的大小采用5mL醫(yī)用注射器成型，在此條件下包埋率最高可達(dá)95.69%，保存時(shí)間可達(dá)1個(gè)月。嗜熱鏈球菌經(jīng)過(guò)海藻酸鈉包埋后，具有比較穩(wěn)定的生物活性和耐

4、久保存特性，為益生菌制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用方面提供了參考。</p><p>　　關(guān)鍵詞:嗜熱鏈球菌；包埋；海藻酸鈉</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　This study was from the city of the sale of milk in the isolated from Streptococc

5、us thermophilus,with sodium alginate as entrapment agent,on Streptococcus thermophilus by embedded.By the dilution plate count to determination of lactic acid in Streptococcus thermophilus viable count,investigated the c

6、oncentration of calcium chloride and sodium alginate,gel bead size,save time on Streptococcus thermophilus embedding rate effect.Results show that proper embedding conditions for the concentration of</p><p>

7、　　Key words: Streptococcus thermopHilus; Embedding; Sodium alginate</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　1 前言................................................................................

8、..........................................1</p><p>　　2 材料和方法..............................................................................................................3</p><p>　　2.1 材料與儀器設(shè)備..

9、.............................................................................................3</p><p>　　2.1.1 試劑...............................................................................................

10、.............3</p><p>　　2.1.2 儀器............................................................................................................3</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法...................................

11、........................................................................4</p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基及溶液的配制................................................................................4</p><p>　　2.2.2

12、 嗜熱鏈球菌的分離....................................................................................5</p><p>　　2.2.3 革蘭氏染色............................................................................................

13、....5</p><p>　　2.2.4 菌種保藏....................................................................................................5</p><p>　　2.2.5 嗜熱鏈球菌包埋.............................................

14、...........................................5</p><p>　　2.2.6 平板稀釋計(jì)數(shù)............................................................................................6</p><p>　　2.2.7 包埋凝膠珠的溶解...........

15、.........................................................................6</p><p>　　2.2.8 包埋率計(jì)算................................................................................................6</p><

16、;p>　　2.2.9 包埋條件的研究........................................................................................6</p><p>　　3 結(jié)果與分析................................................................................

17、..............................7</p><p>　　3.1 嗜熱鏈球菌分離結(jié)果.......................................................................................7</p><p>　　3.2 包埋條件對(duì)包埋率影響的研究.........................

18、..............................................7</p><p>　　3.2.1 海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響................................................................7</p><p>　　3.2.2 氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響.........................

19、...........................................8</p><p>　　3.2.3 凝膠珠大小對(duì)包埋率的影響....................................................................9</p><p>　　3.2.4 保存時(shí)間對(duì)包埋率的影響..........................

20、............................................10</p><p>　　4 結(jié)論........................................................................................................................11</p><p>　　參考

21、文獻(xiàn)....................................................................................................................12</p><p>　　致 謝.........................................................................

22、...............................................13</p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1乳酸菌概況</b></p><p>　　乳酸菌是指能發(fā)酵的碳水化合物(如葡萄糖)產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過(guò)

23、程中產(chǎn)生乳酸菌的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌。這是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，至少目前可分為18個(gè)屬，共有200多種。除了極少數(shù)以外，其中絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的并且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。</p><p>　　在豐富的細(xì)菌資源中，有些細(xì)菌具有改善宿主微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，使宿主能夠提高健康水平和健康狀態(tài)，被稱為益生菌。乳酸菌是益生菌中最重要的一群，乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌，乳酸菌能夠?qū)⑻?/p>

24、水化合物發(fā)酵成乳酸，因而得名。據(jù)研究益生菌活菌制劑及其代謝產(chǎn)物具有諸多保健功能，因此常被視為健康食品，添加在食品之中。較常用的乳酸菌益生菌有雙歧桿菌、乳桿菌和嗜熱鏈球菌等[1]。</p><p>　　乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、醇類及各種氨基酸等代謝物，具有抑制腐敗菌、提高消化率、防癌等生理功效[2]。乳酸菌除了增加體內(nèi)的有益細(xì)菌、增強(qiáng)免疫力之外，還有下列功能：有色人種防治普遍患有的乳糖不耐癥（喝鮮奶時(shí)出現(xiàn)的腹

25、脹、腹瀉等癥狀）；促進(jìn)蛋白質(zhì)、單糖及鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生維生素B族等大量有益物質(zhì)；使腸道菌群的構(gòu)成發(fā)生有益變化，改善人體胃腸道功能，恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護(hù)人體健康；抑制腐敗菌的繁殖，消解腐敗菌產(chǎn)生的毒素，清除腸道垃圾[3]；抑制膽固醇吸收，降血脂、降血壓；免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)人體免疫力和抵抗力；抗腫瘤、預(yù)防癌癥；提高SOD酶活力，消除人體自由基，具抗衰老、延年益壽的作用；有效預(yù)防女性泌尿生殖系統(tǒng)細(xì)菌感染。控

26、制人體內(nèi)毒素水平，保護(hù)肝臟并增強(qiáng)肝臟的解毒、排毒功能等[4]。</p><p>　　乳酸菌制劑或發(fā)酵乳被證明具有抑制動(dòng)物體內(nèi)移植癌或化學(xué)自發(fā)癌癌細(xì)胞的增值，也有抑制長(zhǎng)期人工飼養(yǎng)動(dòng)物的自然發(fā)癌效果。所做調(diào)查研究也顯示攝入發(fā)酵乳可抑制乳癌發(fā)生，以及膀胱癌的再發(fā)生[5]。世界發(fā)達(dá)國(guó)家首先認(rèn)識(shí)并開(kāi)創(chuàng)了以使用乳酸菌為代表的免疫療法革命。瑞典科學(xué)家研究發(fā)布的結(jié)果是，治療胃和大腸炎癥時(shí)直接喝乳酸菌比使用抗生素效果更好，危險(xiǎn)性幾

27、乎為零。其作用機(jī)理也由動(dòng)物及人體實(shí)驗(yàn)逐漸證明是因?yàn)槊庖哒{(diào)節(jié)作用以及抑制腸內(nèi)菌叢產(chǎn)生致癌關(guān)聯(lián)物質(zhì)[6]。</p><p>　　1.2嗜熱鏈球菌概況</p><p>　　嗜熱鏈球菌來(lái)源于乳制品。它是一種耗氧的格蘭氏陽(yáng)性菌，以兩個(gè)卵圓型為一對(duì)的球菌組成約0.7到0.9納米的長(zhǎng)鏈。在選擇性培養(yǎng)基中，嗜熱鏈球菌會(huì)長(zhǎng)成米色的菌落。嗜熱鏈球菌作為乳酸菌中的一種益生菌除了具有益生菌的生理特性外還有其自身的

28、生理特性：對(duì)胃酸有良好的耐受性，嗜熱鏈球菌在pH6.8的酸性溶液中的存活率是100%，在pH4的酸性溶液中的存活率約是75%，在pH3的酸性溶液中的存活率約是70%；對(duì)膽鹽的耐受性好，膽鹽對(duì)嗜熱鏈球的生長(zhǎng)有一定的抑制作用（抑制率約為28%）。然而嗜熱鏈球菌依舊能夠在較高濃度的膽汁中生存，所以可以在人體內(nèi)免受膽汁的損害而到達(dá)小腸的遠(yuǎn)端；對(duì)腸道致病菌的抑制，嗜熱鏈球菌能使艱難梭菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的菌落直徑減少約30%；能使金黃色葡

29、萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落直徑減少約20%。</p><p>　　1.3 乳酸菌固定化</p><p>　　細(xì)胞固定化是指用物理或化學(xué)方法使酶成為不溶性衍生物或使細(xì)胞成為不易從載體上流失的形式制成生物反應(yīng)器用以催化生化反應(yīng)、細(xì)胞數(shù)量的增殖的方法。它包括固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)兩種。固定化細(xì)胞載體主要可分為兩大類，一類是無(wú)機(jī)載體，如硅藻土、活性炭等；另一類是有機(jī)載體

30、，又可分為兩種，一種為天然高分子凝膠載體，如瓊脂、角叉萊膠和海藻酸鈣等，它們無(wú)生物毒性，傳質(zhì)性好，但強(qiáng)度低，在厭氧條件下易被生物分解。另一種是有機(jī)合成高分子凝膠載體，如聚丙烯酰銨凝膠、聚乙烯醇凝膠等，一般強(qiáng)度較好，但傳質(zhì)性能較差，包埋后對(duì)細(xì)胞活性有影響。常用的微生物固定化方法一般來(lái)說(shuō)，大致可以分成吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法四大類，本研究采用的是包埋法。 </p><p>　　由于乳酸菌的培養(yǎng)增殖難度高、對(duì)

31、外抵抗力差，在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和應(yīng)用過(guò)程中大量死亡，嚴(yán)重影響了微生態(tài)制劑的效能。因此為了提高乳酸菌應(yīng)用的方便性與時(shí)效性，就要采用不同的包埋法對(duì)乳酸菌進(jìn)行固定化[7]。由于瓊脂的硬度較差，聚丙烯酰胺凝膠具有毒性，明膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)密實(shí)但是傳質(zhì)性能差，而海藻酸鈉凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性能都較好，并且對(duì)生物無(wú)毒性，抗生物分解性良好，是比較合適的固定化細(xì)胞載體。采用海藻酸鈉做包埋劑，氯化鈣做成型劑及硬化劑，用醫(yī)用注射器擠壓來(lái)制備乳酸菌凝膠珠。通過(guò)測(cè)定其活菌數(shù)

32、，對(duì)海藻酸鈉及氯化鈣的濃度進(jìn)行研究，確定海藻酸鈉包埋乳酸菌的工藝條件。</p><p>　　1.4 本研究的目的和意義</p><p>　　乳酸菌是乳品發(fā)酵菌種之一，也是益生菌制劑的主要菌種之一?，F(xiàn)多用于添加到傳統(tǒng)不同類型食品中作為發(fā)酵劑，如發(fā)酵乳、奶酪等，以及功能性食品、飼料中的添加劑。而目前生產(chǎn)所用乳酸菌一般都需經(jīng)多次活化和多次擴(kuò)大培養(yǎng)制成生產(chǎn)發(fā)酵劑后才能使用。嗜熱鏈球菌獲得的過(guò)程既費(fèi)

33、時(shí)又費(fèi)工，極不方便，包埋則是提高細(xì)菌活性的一種有效方法，將細(xì)菌包埋在保護(hù)性結(jié)構(gòu)中，能增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)極端條件的抗性，提高細(xì)菌在體系中的存活率。為了提高生產(chǎn)制作工藝的方便性與時(shí)效性，本研究采用海藻酸鈉包埋法對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行固定化，嗜熱鏈球菌菌種均勻地包埋在載體中，使細(xì)菌細(xì)胞中的酶處于原始活性狀態(tài)，使乳酸菌的儲(chǔ)存，運(yùn)送以及加工過(guò)程酶活性提高，活力增強(qiáng)，耐持久性增加，為乳酸菌作為發(fā)酵菌種、作為益生菌添加劑的使用建立一個(gè)良好的基礎(chǔ)[8]。</p

34、><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p>　　2.1材料與儀器設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1試劑</b></p><p>　　本研究所用試劑如表1所示。</p><p>　　表1 主要實(shí)驗(yàn)試劑</p><p><b

35、>　　2.1.2儀器設(shè)備</b></p><p>　　本研究所用儀器如表2所示。</p><p>　　表2 主要實(shí)驗(yàn)儀器</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)基及溶液的配制</p><p>　　2.2.1.1 M17培養(yǎng)基&

36、lt;/p><p>　　稱取胰蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，大豆蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，抗壞血酸0.5g，硫酸鎂0.25g，磷酸甘油二鈉19.0g，乳糖5g，瓊脂20 g，分別溶于一定量蒸餾水1000mL，溶解加熱混勻后配制成溶液。再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.9±0.2。然后在121℃下用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌15min，等到冷卻后倒入平板備用。</p><p>　　2.2.1

37、.2緩沖液的制備</p><p>　　稱取磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鈉0.48g，氯化鈉0.75g，吐溫80 0.05g放入蒸餾水100毫升中混勻，制作成緩沖液備用。</p><p>　　2.2.1.3 海藻酸鈉的配制</p><p>　　稱取海藻酸鈉1g放入100mL蒸餾水中，加熱攪拌使其充分溶解混勻，冷卻至室溫后備用。再稱取2g、3g、4g、5g的海藻酸鈉，用

38、同樣方法制成不同濃度的溶液備用。</p><p>　　2.2.1.3 氯化鈣溶液的配置</p><p>　　稱取無(wú)水氯化鈣35g，放入1000mL蒸餾水中充分?jǐn)嚢枞芙?，制成溶液備用。再稱取2g、4g、6g、8g氯化鈣用同上方法制成不同濃度氯化鈣溶液備用。</p><p>　　2.2.1.4 蔗糖溶液的配制</p><p>　　稱取蔗糖500g

39、，放入1000mL蒸餾水中加熱攪拌使其充分溶解，冷卻到室溫后備用。</p><p>　　2.2.1.5 生理鹽水的配制</p><p>　　稱取氯化鈉10g，放入1000mL蒸餾水中震蕩充分溶解，封口后放入滅菌鍋中121℃滅菌15分鐘，冷卻到室溫后備用。</p><p>　　2.2.2 嗜熱鏈球菌的分離</p><p>　　取市場(chǎng)上買的光明乳

40、業(yè)酸奶10mL放入無(wú)菌三角瓶中，并加入90mL無(wú)菌生理鹽水，充分溶解混勻制成菌夜。從三角瓶取出1mL菌液，放于一試管中，再加入9mL無(wú)菌生理鹽水。從試管中取出1mL菌液，放到另一個(gè)試管中，再加入9mL無(wú)菌生理鹽水，如此再稀釋1次[9]。從每個(gè)試管中取菌液分別涂布于配置好的M17瓊脂培養(yǎng)基平板平板上，稀釋菌液放置于冰箱中備用，M17平板放到恒溫培養(yǎng)箱（37±1）℃中培養(yǎng)24h天。用接種環(huán)從培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿中挑出嗜熱鏈球菌（嗜熱鏈球

41、菌在平板上的形態(tài)為半濕潤(rùn)表面光滑），畫線到配置好的M17培養(yǎng)基平板上，然后把M17平板放到恒溫培養(yǎng)箱（37±1）℃中第二次培養(yǎng)24h天等待計(jì)數(shù)[10]。把培養(yǎng)好的菌種挑出制作成玻片進(jìn)行革蘭氏染色，然后鏡檢觀察嗜熱鏈球菌菌種。</p><p>　　2.2.3革蘭氏染色</p><p>　　在載玻片上滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取菌種放入玻片上的蒸餾水中。在酒精燈下烘烤（玻片溫度不能過(guò)高

42、避免燒死所選菌種）使水分蒸干，固定好菌種。滴入結(jié)晶紫染色1分鐘，用自來(lái)水沖洗。再加碘液覆蓋涂面染1分鐘，用自來(lái)水沖洗，吸水紙吸取水分。之后用酒精脫色約30秒，吸去水分。再滴入番紅復(fù)染1分鐘，用自來(lái)水沖洗[11-12]。待干燥后鏡檢。</p><p><b>　　2.2.4菌種保藏</b></p><p>　　選用兩種不同保藏方法。一是液體石蠟保藏法：將液體石蠟裝于三角

43、燒瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121℃滅菌30分鐘，然后放在40℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。將嗜熱鏈球菌在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到健壯的菌體。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好菌的斜面上，用量以高出斜面頂端1厘米為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，放置在低溫下保存。二是斜面低溫保藏法：將嗜熱鏈球菌接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長(zhǎng)后，用棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏[13]。</p>

44、<p>　　2.2.5 嗜熱鏈球菌包埋</p><p>　　將培養(yǎng)48h的嗜熱鏈球菌制備成106cfu/mL左右的菌懸液，將3mL懸液加入溫度適當(dāng)?shù)暮Ｔ逅徕c溶液和50%蔗糖溶液，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?5分鐘(250r/min)，用醫(yī)用注射器注入氯化鈣無(wú)菌溶液中成型，撈出后在氯化鈣溶液浸泡5-10min進(jìn)行硬化處理，完成后撈出凝膠珠，用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次，洗去凝膠珠表面的氯化鈣。最后將形狀均勻的圓型

45、凝膠珠裝入無(wú)菌的磨口小瓶中，放置于4℃中備用[14]。</p><p>　　2.2.6 平板稀釋計(jì)數(shù)</p><p>　　取菌懸液0.1mL在M17培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，37℃恒溫培養(yǎng)24h后計(jì)活菌數(shù)。</p><p>　　2.2.7 包埋凝膠珠的溶解</p><p>　　秤取1.0g凝膠珠樣品溶于9mL緩沖液中，先以磁力攪拌器充分?jǐn)嚢鑼竦木?/p>

46、體溶出，然后取0.1mL菌液在M17培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，37℃恒溫培養(yǎng)24h之后計(jì)活菌數(shù)。</p><p>　　2.2.8 包埋率計(jì)算</p><p>　　活菌率為所選單位重量(1g)產(chǎn)品中所包埋的活菌數(shù)。</p><p>　　活菌率(cfu/g)=(一定稀釋度下的活菌數(shù)×稀釋倍數(shù)×總液量)/樣品的量。</p><p>　　

47、包埋率(%)=產(chǎn)品總活菌數(shù)/包埋時(shí)所用菌懸液總菌數(shù)。</p><p>　　2.2.9 包埋條件的研究</p><p>　　2.2.9.1 海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響</p><p>　　分別配制濃度為1%、2%、3%、4%、5%的海藻酸鈉溶液，在氯化鈣濃度為1%，注射器大小為5mL時(shí)進(jìn)行包埋。然后溶解凝膠珠進(jìn)行涂布平板培養(yǎng)，之后分別計(jì)算其包埋率。</p>

48、<p>　　2.2.9.2 CaCl2濃度對(duì)包埋率的影響</p><p>　　分別配置濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的氯化鈣溶液，在海藻酸鈉濃度為4%，注射器大小為5mL時(shí)進(jìn)行包埋。然后溶解凝膠珠進(jìn)行涂布平板培養(yǎng)，之后分別計(jì)算其包埋率。</p><p>　　2.2.9.3凝膠珠大小對(duì)包埋率的影響</p><p>　　分別選擇5mL、10m

49、L、20mL注射器，在海藻酸鈉濃度為4%，氯化鈣濃度為1%時(shí)進(jìn)行包埋。然后溶解凝膠珠進(jìn)行涂布平板培養(yǎng)，之后分別計(jì)算計(jì)算其包埋率。</p><p>　　2.2.9.4包埋凝膠珠的保存時(shí)間</p><p>　　配置海藻酸鈉濃度為4%、氯化鈣濃度為1%的溶液，用5mL注射器成型凝膠珠進(jìn)行包埋。然后分別在保存15天、30天、45天、60天后對(duì)包埋的凝膠珠進(jìn)行溶解涂布平板培養(yǎng)，分別計(jì)算其包埋率。&l

50、t;/p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 嗜熱鏈球菌分離結(jié)果</p><p>　　經(jīng)過(guò)兩次在M17培養(yǎng)基上的畫線分離培養(yǎng)，市售酸奶中的桿菌已經(jīng)消失，只剩下了球菌。培養(yǎng)基上的表現(xiàn)為生成大量菌落、菌落較大、白色圓形邊緣整齊、有濕潤(rùn)感。觀察到的嗜熱鏈球菌與《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》描繪的嗜熱鏈球菌特征一致。革蘭

51、氏染色后的鏡檢結(jié)果如圖1所示。</p><p>　　圖1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果</p><p>　　3.2 包埋條件對(duì)包埋率影響的研究</p><p>　　3.2.1海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響</p><p>　　將1%、2%、3%、4%、5%的海藻酸鈉溶液在1%的氯化鈣溶液下用5mL注射器包埋。海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響如圖2所示。<

52、/p><p>　　圖2 海藻酸鈉濃度對(duì)包埋率的影響</p><p>　　圖3 海藻酸鈉濃度對(duì)活菌數(shù)的影響</p><p>　　由圖2、3可知海藻酸鈉濃度對(duì)嗜熱鏈球菌的包埋率以及活菌數(shù)都有一定的影響。當(dāng)海藻酸鈉的濃度為4%時(shí)，活菌數(shù)以及包埋率都達(dá)到了最大值。當(dāng)海藻酸鈉濃度由低到高逐漸增大時(shí)，活菌數(shù)也逐漸增加，包埋率也有相應(yīng)的提高；而當(dāng)濃度大于4%時(shí)，活菌數(shù)開(kāi)始減少，包

53、埋率也相應(yīng)的降低。同時(shí)通過(guò)活菌數(shù)以及包埋率的數(shù)值可知，其增加率或者降低率并不是呈線性關(guān)系的，這可能是由于海藻酸鈉的濃度不同，其內(nèi)部空間大小不同以及凝膠珠成型時(shí)有些不是圓形導(dǎo)致的。馬莉，羅俊成等人[15]在固定枯草芽孢桿菌的研究中，海藻酸鈉的濃度的研究也有類似結(jié)果。</p><p>　　3.2.2 氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響</p><p>　　將0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的氯化鈣

54、溶液在4%的海藻酸鈉溶液下用5mL注射器包埋，氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響如圖4所示。</p><p>　　圖4 氯化鈣濃度對(duì)包埋率的影響</p><p>　　圖5 氯化鈣濃度對(duì)活菌數(shù)的影響</p><p>　　由圖4、5可知氯化鈣的濃度對(duì)嗜熱鏈球菌的包埋存在一定的影響。比較合適的氯化鈣濃度為1.0%-1.5% ，此時(shí)的包埋率可達(dá)到95%左右。而當(dāng)氯化鈣濃度低于1.

55、0%或高于1.5%時(shí)，包埋率則明顯有下降趨勢(shì)。這可能是由于海藻酸鈉中的鈉離子沒(méi)有全部被合適的鈣離子所取代，從而導(dǎo)致了凝膠珠內(nèi)部的結(jié)構(gòu)分布不一樣，而表現(xiàn)出來(lái)的就是凝膠珠中所含菌數(shù)有差異，則包埋率也會(huì)有較大差異。本試驗(yàn)研究結(jié)果與張強(qiáng)，馬齊等人[16]在海藻酸鈉包埋乳酸菌及活性分析研究中相似。</p><p>　　3.2.3 凝膠珠大小對(duì)包埋率的影響</p><p>　　將不同大小的凝膠珠在4%

56、海藻酸鈉溶液和1%氯化鈣溶液下進(jìn)行包埋，凝</p><p>　　珠大小對(duì)包埋率的影響如圖6所示。</p><p>　　圖6 凝膠珠大小對(duì)包埋率的影響</p><p>　　圖7 凝膠珠大小對(duì)活菌數(shù)的影響</p><p>　　由于實(shí)驗(yàn)采用的是醫(yī)用注射器進(jìn)對(duì)凝膠珠進(jìn)行成型的，因此可通過(guò)改變注射器的型號(hào)來(lái)達(dá)到改變凝膠珠大小的目地。由圖6、7可知凝

57、膠珠的大小對(duì)包埋率同樣存在一定程度上的影響，凝膠珠直徑越大，包埋率則越小活菌數(shù)越少。從包埋率的數(shù)值上可以看出，三種凝膠珠大小的包埋率均在90%左右，有一定差異但是不大，這可能是由于包埋劑成型時(shí)，液滴的大小影響了海藻酸鈉在氯化鈣中成型的時(shí)間，從而導(dǎo)致了部分菌體溢出了海藻酸鈉使包埋率產(chǎn)生了差異。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)論與張強(qiáng)，馬齊，徐升運(yùn)，陳衛(wèi)峰等人[16]所做實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。</p><p>　　3.2.4 保存時(shí)間對(duì)包埋率的影

58、響</p><p>　　將包埋好的凝膠珠存放15天，30天，45天，60天后分別進(jìn)行溶解涂布，計(jì)算其包埋率的變化，保存時(shí)間對(duì)包埋率的影響如圖8所示。</p><p>　　圖8 保存時(shí)間對(duì)包埋率的影響</p><p>　　圖9 保存時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響</p><p>　　由圖8、9可以看出凝膠珠的存放時(shí)間也對(duì)包埋率有一定的影響，保存時(shí)間在1

59、5-30天時(shí)包埋率都在90%左右，而30天之后的包埋率開(kāi)始逐漸下降，存放時(shí)間越長(zhǎng)則包埋率越低。分析推測(cè)是由于分離菌種活性不夠高，故使保存時(shí)間變短。并且凝膠珠存放于室溫下，推測(cè)天氣逐漸變熱也可能是使存放時(shí)間變短的原因。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本試驗(yàn)采用M17培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，M17培養(yǎng)基是酸奶中嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)的重要培養(yǎng)基也是

60、從酸奶或牛奶中分離嗜熱鏈球菌的常用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基分離嗜熱鏈球菌菌落較大、菌落容易觀察，效果較好[17]。有報(bào)道采用溴甲酚綠（BCG）牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板也具有較好的分離效果與酸奶中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定[18]中也有相似結(jié)論。</p><p>　　通過(guò)采用不同梯度稀釋然后在M17培養(yǎng)基上平板畫線觀察計(jì)數(shù)的方法，測(cè)定了海藻酸鈉凝膠珠的活菌數(shù)，同時(shí)也確定了海藻酸鈉包埋嗜熱鏈球菌的較好工藝：海藻酸鈉濃為4%，定型劑為氯化

61、鈣濃度為1.0%，硬化劑為氯化鈣濃度為3.5%，凝膠珠大小的控制采用不同型號(hào)的醫(yī)用注射器。在此包埋工藝條件下，嗜熱鏈球菌的包埋率最高可達(dá)95.69%。</p><p>　　海藻酸鈉凝膠珠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)為蜂窩狀，經(jīng)過(guò)海藻酸鈉包埋后的嗜熱鏈球菌其耐高溫性、耐持久貯存特性和對(duì)外抵抗力都會(huì)有顯著的提高。這就為微生物制劑的研發(fā)應(yīng)用以及動(dòng)物飼料的制作、運(yùn)輸、儲(chǔ)存提供了足夠的科學(xué)依據(jù)。</p><p>　　

62、在對(duì)嗜熱鏈球菌的微生物制品或者其本身進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中盡量選取活性較高的菌種，這樣在長(zhǎng)時(shí)間的保存過(guò)程中能保證其存活率。在運(yùn)輸時(shí)盡量使溫度保持恒定，過(guò)高和過(guò)低都會(huì)使其失去活性甚至死亡[19]。并且儲(chǔ)藏時(shí)間不能過(guò)久，要在其活性最好時(shí)使用以免其活性降低造成生產(chǎn)損失。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 劉振民,駱承庠.乳酸菌發(fā)酵劑生

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