肺炎鏈球菌疫苗蛋白ΔA146Ply的礦化納米顆粒制備及其保護(hù)效應(yīng)評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumonia,S.pn）是在全球范圍內(nèi)引起侵襲性細(xì)菌性疾病的主要原因之一，疫苗是控制其感染致病的有效手段。由于臨床使用疫苗的局限性，有必要開(kāi)發(fā)一種具備誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答能力且低毒副作用的新型疫苗。蛋白疫苗由于其保守性高，制備簡(jiǎn)單，能激活有效B、T細(xì)胞免疫，是目前疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)類(lèi)型。但單獨(dú)的蛋白免疫原性不夠高，需要添加佐劑輔助免疫。而有研究表明，納米顆粒形式的疫苗能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫

2、反應(yīng)。因此，本研究擬使用生物礦化肽PA44、NW、N6、W6將肺炎鏈球菌蛋白ΔA146Ply制備為礦化納米顆粒，并通過(guò)觀測(cè)其免疫保護(hù)效果及安全性以評(píng)價(jià)該方法的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　通過(guò)分子克隆技術(shù)表達(dá)含生物礦化肽的疫苗蛋白ΔA146Ply-PA44、ΔA146Ply-NW、ΔA146Ply-N6、ΔA146Ply-W6以及ΔA146Ply，并純化、去內(nèi)毒素。利用馮庫(kù)薩染色確定蛋白ΔA146Ply-PA44，ΔA146P

3、ly-NW，ΔA146Ply-N6，ΔA146Ply-W6具備螯合磷酸鈣的能力。在富含 Ca2+和 PO43-的弱堿性溶液中，蛋白ΔA146Ply-PA44、ΔA146Ply-NW、ΔA146Ply-N6、ΔA146Ply-W6通過(guò)螯合磷酸鈣發(fā)生礦化，使用透射電鏡（TEM）、X射線光電子能譜（XPS）等對(duì)礦化產(chǎn)物進(jìn)行分析。將可溶性蛋白ΔA146Ply、ΔA146Ply-PA44、ΔA146Ply-NW、ΔA146Ply-N6、ΔA146

4、Ply-W6及其礦化納米顆粒分別刺激體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs），通過(guò)分泌細(xì)胞因子的情況來(lái)評(píng)估納米顆粒對(duì)抗原提呈的影響。將上述可溶性蛋白和礦化納米顆粒分別經(jīng)皮下免疫小鼠，采用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)、脾細(xì)胞因子，末次免疫后構(gòu)建敗血癥模型及肺炎模型，觀測(cè)小鼠生存率、肺部定植、肺部炎癥等以評(píng)價(jià)礦化納米顆粒的保護(hù)效應(yīng)。通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)、免疫動(dòng)物的體重變化、免疫位點(diǎn)結(jié)節(jié)/腫塊觀察等實(shí)驗(yàn)評(píng)估礦化納米顆粒的安全性。
　　結(jié)果：

5、r>　　成功制備蛋白ΔA146Ply-PA44，ΔA146Ply-NW，ΔA146Ply-N6，ΔA146Ply-W6，ΔA146Ply，純度達(dá)到90%以上。蛋白ΔA146Ply-PA44，ΔA146Ply-NW，ΔA146Ply-N6，ΔA146Ply-W6具有螯合磷酸鈣的能力，并可形成不同密度、直徑的納米顆粒（ΔA146Ply-PA44@CaP、ΔA146Ply-NW@CaP、ΔA146Ply-N6@CaP、ΔA146Ply-W6@

6、CaP）。相較于ΔA146Ply，所有礦化蛋白納米顆粒均可在體外刺激 BMDCs分泌更高濃度的IL-6和TNF-α，其中ΔA146Ply-PA44@CaP和ΔA146Ply-NW@CaP較其可溶性蛋白組刺激BMDCs產(chǎn)生的IL-6和TNF-α水平顯著增高。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，所有礦化納米顆粒免疫組較ΔA146Ply免疫組可產(chǎn)生更高的特異性抗體效價(jià)、脾細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4及IL-17A，相較于其可溶性蛋白免疫組可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌更多的

7、IL-4和IL-17A，ΔA146Ply-PA44@CaP、ΔA146Ply-NW@CaP及ΔA146Ply-W6@CaP免疫組相較于含鋁佐劑的可溶性蛋白組可產(chǎn)生更高水平的IL-4。ΔA146Ply-PA44@CaP和ΔA146Ply-W6@CaP免疫組在敗血癥模型中展現(xiàn)出可比擬陽(yáng)性對(duì)照（PPV23）的保護(hù)效果。所有礦化納米顆粒免疫組在肺炎模型中均呈現(xiàn)較可溶性蛋白免疫組及含鋁佐劑的可溶性蛋白免疫組更低的肺部定植以及更弱的肺部炎癥浸潤(rùn)。安