黏膜免疫殼聚糖包裹的PsaA納米顆粒預(yù)防肺炎鏈球菌感染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:肺炎鏈球菌是引起腦膜炎、敗血癥、菌血癥性肺炎等侵襲性疾病以及中耳炎、鼻竇炎等非侵襲性疾病最為常見的一種病原體,在全球范圍內(nèi)每年大約有160萬人死于肺炎鏈球菌疾病,其中大部分來自發(fā)展中國家。目前,市場上預(yù)防肺炎鏈球菌疾病的疫苗有兩類,一類是23價(jià)多糖疫苗,另一類是7價(jià)和13價(jià)多糖蛋白結(jié)合疫苗,前者對于2歲以下兒童、免疫缺陷患者和老人保護(hù)性弱,后者包含的血清型有限且易引起血清型替換。因此,研制一種無血清型限制的新型肺炎鏈球菌疫苗勢

2、在必行;肺炎鏈球菌表面黏附素A(PsaA)是存在于所有肺炎鏈球菌表面高度保守的蛋白,是一種理想的候選抗原;肺炎鏈球菌在人類主要定植于鼻咽部,通過咽鼓管途徑進(jìn)入中耳引起急性中耳炎,通過呼吸道進(jìn)入肺部引起肺炎,進(jìn)而有可能通過血流引起菌血癥和腦膜炎,因此局部的黏膜免疫反應(yīng)對于預(yù)防肺炎鏈球菌感染至關(guān)重要;黏膜免疫是一種有效的誘發(fā)局部免疫力的策略,然而鼻黏膜表面富含的纖毛、粘液,分泌的蛋白核酸酶以及上皮屏障使得抗原很難吸收,需要合適的黏膜輸送系統(tǒng)

3、或佐劑,殼聚糖(chitosan)是一種有效的黏膜輸送系統(tǒng),與蛋白或核酸結(jié)合形成納米顆粒,有利于抗原的吸收。因此,在本項(xiàng)研究中采用chitosan作為PsaA蛋白和核酸的黏膜輸送系統(tǒng)。
　　目的:研究chitosan包裹PsaA重組蛋白或核酸形成的納米顆粒經(jīng)鼻腔黏膜途徑免疫在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答能力以及對肺炎鏈球菌急性中耳炎、敗血癥和鼻咽部定植的保護(hù)作用。共分三部分:(1)殼聚糖包裹的PsaA重組蛋白納米顆粒的

4、制備及黏膜免疫誘生特異性免疫應(yīng)答研究;(2)黏膜免疫chitosan-PsaA納米顆粒預(yù)防急性中耳炎和敗血癥研究;(3)黏膜免疫殼聚糖包裹的PsaADNA納米顆粒預(yù)防肺炎鏈球菌鼻咽部定植作用研究。
　　方法:(1)chitosan-PsaA納米顆粒的制備:PCR法從肺炎鏈球菌基因組擴(kuò)增PsaA基因,與pET28a構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-psaA,以其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)PsaA蛋白,親和層析獲得純化的

5、PsaA蛋白,westernblot鑒定其抗原性;采用離子交聯(lián)技術(shù)制備chitosan-PsaA納米顆粒,并檢測其粒徑及電位;(2)鼻腔接種chitosan-PsaA納米顆粒誘生免疫應(yīng)答研究:將制備的chitosan-PsaA納米顆粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分別鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集鼻腔灌洗液(nasalwashes)、中耳灌洗液(MEL)及支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測特異性IgA抗體反應(yīng);收集血清,

6、檢測特異性IgG抗體反應(yīng);分離并培養(yǎng)脾細(xì)胞,檢測IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;(3)chitosan-PsaA納米顆粒預(yù)防急性中耳炎研究:以chitosan-PsaA納米顆粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分別鼻腔免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,小鼠中耳聽泡注射14型肺炎鏈球菌,分別于攻毒后3天和7天進(jìn)行中耳菌落計(jì)數(shù)及中耳組織病理學(xué)檢查,并收集中耳支氣管肺泡灌洗液;(4)chitosan-PsaA納

7、米顆粒預(yù)防敗血癥研究:以chitosan-PsaA納米顆粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分別免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,腹腔分別注射3型和14型肺炎鏈球菌,觀察小鼠21天內(nèi)的存活率;(5)黏膜免疫保護(hù)機(jī)制探討:檢測小鼠免疫血清中特異性抗體的結(jié)合功能、抑制黏附功能以及調(diào)理吞噬功能;雙抗夾心法檢測免疫小鼠中耳攻毒前、攻毒后3天和7天支氣管肺泡灌洗液中IL-17A水平;(6)黏膜免疫殼聚糖包裹的PsaADNA納米顆

8、粒預(yù)防肺炎鏈球菌鼻咽部定植作用研究:PCR法從3型肺炎鏈球菌基因組擴(kuò)增Psa,A基因,與pVAX1構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-psaA,RT-PCR及Westernblot鑒定pVAX1-psaA在體外真核細(xì)胞中的表達(dá);復(fù)凝聚法制備chitosan-psaA納米顆粒,并檢測其粒徑及電位大小,通過與DnaseⅠ共培養(yǎng)評估chitosan保護(hù)DNA免遭降解的能力;用制備好的chitosan-psaA納米顆粒、pVAX1-psaA(naked

9、psaA)、chitosan-pVAX1分別免疫BALB/c小鼠,每兩周一次,連續(xù)4次,末次免疫后2周,收集鼻腔、中耳及支氣管肺泡灌洗液檢測特異性IgA抗體反應(yīng);收集血清檢測特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體反應(yīng);分離并培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞,檢測IL-17A及工FN-γ的分泌水平;鼻腔滴入3型肺炎鏈球菌,5天后通過菌落計(jì)數(shù)評估各免疫組對肺炎鏈球菌鼻咽部定植的保護(hù)作用;收集鼻腔攻毒前及攻毒5天后的支氣管肺泡灌洗液,通過雙抗夾心法檢測IL-1

10、7A水平。
　　結(jié)果:(1)從肺炎鏈球菌基因組成功擴(kuò)增PsaA編碼序列,經(jīng)測序鑒定與GenBank中序列一致,成功構(gòu)建pET28a-psaA原核表達(dá)質(zhì)粒,并利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了可溶性的PsaA蛋白,經(jīng)Westernblot證實(shí)PsaA蛋白具備抗原性;成功制備了大小平均為691nm、表面電位為+21.1mV的chitosan-PsaA納米顆粒;(2)chitosan-PsaA組鼻腔黏膜免疫獲得了較高水平的全面免疫應(yīng)答:鼻腔、中耳和

11、支氣管肺泡灌洗液中特異性IgA抗體水平明顯高于nPsaA和chitosan組(P＜0.05);血清中特異性IgG抗體水平明顯高于nPsaA和chitosan組(P＜0.05);經(jīng)PsaA抗原刺激后脾細(xì)胞分泌的IL-17A、IL-4及IFN-γ水平明顯高于nPsaA和chirosan組(p＜0.05);(3)評估chitosan-PsaA納米顆粒對急性中耳炎的保護(hù)作用結(jié)果表明,攻毒后3天chitosan-PsaA納米顆粒組中耳的菌落計(jì)數(shù)明

12、顯少于nPsaA和chitosan組(P＜0.05),而攻毒后7天chitoan-PsaA組小鼠均無細(xì)菌定植,與chitosan組相比明顯減少(P＜0.05),nPsaA組4只小鼠有細(xì)菌定植,chitosgtn組6只小鼠有細(xì)菌定植;攻毒后3天和7天chitoan-PsaA組鼓膜的厚度和中耳炎癥細(xì)胞數(shù)均少于nPsaA和chitosan組(P＜0.05);(4)評估chitosan-PsaA納米顆粒預(yù)防敗血癥的研究結(jié)果表明,chitosan

13、-PsaA組3型14型肺炎鏈球菌小鼠的存活率均為100％,與nPsaA和chitosan組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),證實(shí)了該P(yáng)saA疫苗具有交叉保護(hù)性;(5)抗體功能實(shí)驗(yàn)表明chitosan-PsaA組小鼠的血清抗體有較高的抗體結(jié)合功能、抑制黏附功能和調(diào)理吞噬功能,參與了黏膜保護(hù)機(jī)制;黏膜局部IL-17A水平在小鼠中耳攻毒3天開始升高,7天明顯升高,chitosan-PsaA組與nPsaA和chitosan組相比有明顯更高

14、水平的IL-17A(P＜0.05);(6)成功構(gòu)建了pVAX1-psaA真核表達(dá)載體,經(jīng)RT-PCR和Westernblot鑒定該質(zhì)粒可以在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中表達(dá);制備了平均大小為392nm、表面電位為+12.5mY的chitosan-psaA納米顆粒,該納米顆粒具有保護(hù)pVAX1-psaA免遭DnaseⅠ降解作用;chitosan-psaA免疫組在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清中PsaA特異性IgG、IgG1、IgG2a、粘膜IgA抗體水平

15、及IL-17A、IFN-γ水平與裸psaA組及chitosan-pVAX1組相比均明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);chitosan-psaA組較裸psaA組及chitosan-pVAX1組小鼠肺炎鏈球菌鼻咽部的定植量明顯降低(P＜0.05);鼻腔攻毒前黏膜IL-17A水平較低,攻毒后IL-17A水平升高,chitosan-psaA免疫組明顯高于裸psaA組及chitosan-pVAX1組(P＜0.05),提示IL-17A

16、可能參與了局部黏膜免疫,有利于肺炎鏈球菌從鼻咽部的清除。
　　結(jié)論:chitosan不論包裹PsaA蛋白疫苗還是核酸疫苗均能形成納米顆粒,該納米顆粒能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特異性體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答,并對肺炎鏈球菌導(dǎo)致的急性中耳炎、敗血癥和鼻咽部的細(xì)菌定植具有保護(hù)作用;本研究獲得的chitosan-PsaA和chitosan-psaA納米顆粒是一種有效的黏膜免疫疫苗,以其黏膜免疫可望應(yīng)用于肺炎鏈球菌感染的防治研究,該免疫策略研