抗豬鏈球菌卵黃抗體的性質(zhì)和殼聚糖納米微粒制備研究.pdf

1、豬鏈球菌病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展造成極大危害，其中豬鏈球菌2型(SS2)為人畜共患傳染病，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。目前，預(yù)防和治療豬鏈球菌病的主要方法是免疫接種和抗生素治療，但是豬鏈球菌分群復(fù)雜，疫苗更新快，對(duì)抗生素容易產(chǎn)生耐藥性并存在肉制品中的抗生素殘留問(wèn)題。卵黃抗體(IgY)不存在藥物殘留和耐藥性的問(wèn)題，是一種安全、高效、無(wú)公害的生物制品，可替代抗生素用于豬鏈球菌病的日常預(yù)防。
　　 本課題通過(guò)對(duì)豬鏈球菌2型(SS2)抗原活化擴(kuò)培，制備

2、免疫原，免疫健康臨產(chǎn)雞，從高免雞蛋中提取特異性IgY，研究了IgY的熱、酸堿、胃蛋白酶和胰蛋白酶穩(wěn)定性以及親和常數(shù)。為了提高IgY的耐胃酸及酶解穩(wěn)定性，制備載IgY殼聚糖納米微粒并優(yōu)化條件，對(duì)微粒進(jìn)行表征及體外釋放性能研究。
　　 SS2免疫原制備與特異性IgY的制備。SS2菌種經(jīng)顯微鏡鏡檢，活化擴(kuò)培，菌落平板計(jì)數(shù)得菌體濃度為3.4×1010CFU/mL，煮沸滅活，獲得SS2菌體抗原。菌體抗原與佐劑混合制成免疫原，免疫健康臨產(chǎn)雞

3、，經(jīng)4次免疫后，收集免疫后的高免雞蛋（測(cè)得ELISA效價(jià)1∶6400）。從高免雞蛋中分離卵黃，采用水稀釋凍融法、微濾、超濾、鹽析、透析、親和層析等純化方法，得到IgY親和層析樣品，考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)得該IgY樣品的蛋白質(zhì)含量為81mg/mL，SDS-PAGE檢測(cè)IgY純度達(dá)到電泳純，間接ELISA法檢測(cè)IgY效價(jià)為1∶6400。
　　 IgY的性質(zhì)研究。應(yīng)用間接ELESA和SDS-PAGE考察IgY對(duì)溫度、酸堿、胃蛋白酶

4、和胰蛋白酶穩(wěn)定性以及親和常數(shù)，結(jié)果表明:在溫度低于60℃及pH3～10范圍，IgY活性基本保持不變;在模擬胃液(SGF)中溫育4h后，IgY的活性保留率僅為9.3％，表明IgY易被胃蛋白酶分解;在模擬腸液(SIF)中溫育4h后，IgY的活性保留率超過(guò)90％，顯示IgY對(duì)胰蛋白酶穩(wěn)定;非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)IgY樣品的親和常數(shù)為8.4×108L/mol。
　　 載IgY殼聚糖納米微粒的制備、表征及體外釋放性能檢測(cè)。以三聚磷酸鈉為

5、交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法制備載IgY殼聚糖納米微粒，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，CS與TPP質(zhì)量比在3∶1～7∶1的范圍內(nèi)時(shí)才能形成納米微粒，IgY的初始濃度在0.5～3mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨著IgY初始濃度的增加納米微粒的包封率降低而載藥量提高。以IgY的包封率和載藥量為考察指標(biāo)，應(yīng)用星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度、殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比和IgY的質(zhì)量濃度三個(gè)因素的各水平進(jìn)行模型擬合和響應(yīng)面分析，獲得納米微粒的最佳制備工藝:殼聚糖溶液的質(zhì)

6、量濃度0.23g/100mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比3.93∶1，IgY的質(zhì)量濃度2.46mg/mL，包封率(93.26％)和載藥量(25.64％)較高，微粒平均粒徑為424nm，Zeta電位為26.20mV，經(jīng)傅立葉紅外光譜表征，發(fā)現(xiàn)該納米微粒與IgY成功結(jié)合。在pH7.4的PBS中的持續(xù)釋放時(shí)間達(dá)8d，在SGF和SIF中溫育4h后的累計(jì)釋放率超過(guò)了90％，表現(xiàn)出了良好的緩釋性能。載IgY殼聚糖納米微粒，不僅可以使IgY的口服穩(wěn)定性