豬鏈球菌噬菌體SMP裂解酶和受體研究.pdf

1、豬鏈球菌病是一種重要的人獸共患傳染病,能導(dǎo)致仔豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和人的腦膜炎,對公共衛(wèi)生尤其是相應(yīng)從業(yè)人員的生命安全構(gòu)成威脅。因抗生素濫用,導(dǎo)致細菌耐藥,給該病的防控帶來了困難。由噬菌體基因編碼的裂解酶——裂解效率高、與抗生素具協(xié)同作用,且不易產(chǎn)生抗性菌株,是一種頗具潛力的殺菌制劑。本文通過重組表達的方法獲得純化的豬鏈球菌噬菌體裂解酶LySMP,研究了該酶的殺菌作用特點、酶不同結(jié)構(gòu)區(qū)域Lys1、Lys2、Lys3和

2、Lys4的殺菌活性以及應(yīng)用裂解酶全酶治療感染豬鏈球菌的斑馬魚的保護作用。為了獲得具有生物學(xué)活性的豬鏈球菌噬菌體裂解酶LySMP,采用重組表達技術(shù),PCR擴增噬菌體SMP的裂解酶基因,插入pET-28a(+)中,構(gòu)建出重組表達載體pET-lys。將該載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達,獲得55kDa的融合LySMP蛋白。酶譜試驗表明該蛋白具有裂解宿主菌SS2-H的活性。表達產(chǎn)物經(jīng)純化后,濃度可達1-3mg/ml。裂解酶LySMP的體外生物

3、學(xué)活性的研究發(fā)現(xiàn)純化的LySMP需加0.8％β-巰基乙醇方可發(fā)揮裂解作用。同時,細菌用PMSF和溶菌酶處理后也具有更好的裂解效果。平板裂解試驗結(jié)果顯示,LySMP的超聲破碎粗提物裂解譜比原始噬菌體廣。噬菌體的宿主菌僅有2株豬鏈球菌2型,但在17株豬鏈球菌2型中,有15株可被裂解酶裂解,此外,所測的豬鏈球菌7型、9型,馬獸疫鏈球菌亞種以及金黃色葡萄球菌,也可被裂解,不過目前尚未發(fā)現(xiàn)其可裂解大腸桿菌和沙門氏菌。LySMP在37℃,pH5.2

4、的條件下,裂解效率最高。LySMP可使所測細菌濁度下降約1.2-98%不等。為了進一步研究LySMP發(fā)揮裂解功能的區(qū)域,并比較各功能區(qū)與全酶的裂解效率,同樣通過大腸桿菌原核表達技術(shù),針對全酶LySMP上的催化區(qū)和結(jié)合區(qū),進行了四種不同組合的區(qū)域表達。各片段位于LySMP1-243、1-279、2-300和151-443位氨基酸,表達產(chǎn)物命名為Ly1, Lys2,Lys3,Lys4。表達后產(chǎn)物大小分別為32kDa、36kDa、39kDa和

5、37kDa。酶譜試驗顯示,Lys1和Lys2蛋白具有裂解宿主菌SS2-H的活性。而Lys3和Lys4未形成可見的透明條帶。表達產(chǎn)物L(fēng)ys1, Lys2經(jīng)純化后,濃度可達1-3mg/ml。對有較強裂解活性的區(qū)段Lys1和Lys2進行了體外生物學(xué)活性測定和條件優(yōu)化。超聲波處理的Lys1, Lys2粗提物的裂解譜均比原始噬菌體廣,但比全酶LySMP的裂解譜窄。在17株豬鏈球菌2型中,7株可被Lys1和Lys2分別裂解,金黃色葡萄球菌也可被裂解

6、,形成透明的抑菌圈。7型菌株、9型菌株、馬獸疫鏈球菌亞種、大腸桿菌和沙門氏菌均不被裂解,不形成抑菌圈。Lys1中加入0.3%β-巰基乙醇或加入20mM半胱氨酸后酶活性最高;而Lys2中則需加入0.8%β-巰基乙醇或加入15mM半胱氨酸方可使酶活性達到最高。Lys1和Lys2的最佳作用溫度均為37℃,Lys1和Lys2分別在pH5.2和pH6.8的條件下裂解效率最高。濃度均為100mM的Lys1、Lys2和LySMP對SS2-4菌株的裂解

7、試驗結(jié)果顯示,LySMP使細菌濁度下降最多,達到33.7%;其次是Lys2,下降27.2%;Lys1最低,只有8.9%。為了研究裂解酶的體內(nèi)抗菌效果,選用裂解活性較強的LySMP,以斑馬魚作為模式動物,統(tǒng)計裂解酶處理組和細菌攻擊對照組斑馬魚的存活率,從而揭示裂解酶的體內(nèi)抗感染效果。試驗研究了LySMP在不同感染階段對豬鏈球菌HA9801的抗感染效果。將斑馬魚分為7組,每組30尾。裂解酶處理組1為在50LD50豬鏈球菌HA9801攻擊前3

8、0min,用2μg LySMP腹腔注射斑馬魚;裂解酶處理組2為用50LD50的豬鏈球菌HA9801與2μg lySMP的混合物(1:1)腹腔注射斑馬魚;裂解酶處理組3為在50LD50豬鏈球菌HA9801攻擊30min后,用2μg LySMP腹腔注射斑馬魚;抗生素處理組用2μg阿莫西林,于50LD50豬鏈球菌HA9801攻擊后30min腹腔注射斑馬魚,計算各組斑馬魚的存活率。同時設(shè)豬鏈球菌HA9801攻擊對照組、PBS對照組、LySMP對

9、照組。結(jié)果表明,裂解酶處理組1、2、3均對豬鏈球菌有抗感染作用,斑馬魚的存活率分別可達70%、66.7%和70%,而HA9801攻擊組存活率僅有6.7%?？股刂委熃M存活率可達96.7%,PBS對照組、LySMP對照組存活率均為100%,表明裂解酶對斑馬魚具有抗感染效果。為了評估LySMP對豬鏈球菌不同血清型、不同菌株的體內(nèi)抗菌活性,選用豬鏈球菌2型SS2-H、SS2-3、豬鏈球菌9型SH040817和豬鏈球菌7型SH040805作為攻

10、擊菌株,分別腹腔注射斑馬魚各30尾,30min后再注射2μg LySMP,計算斑馬魚的存活率。結(jié)果顯示,LySMP注射后能有效抵御豬鏈球菌SS2-H、SS2-3、SH040817及SH040805的攻擊,存活率分別達到90%、93.3%、86.7%及60%。LySMP對SS2-H、SS2-3、SH040805有較強的抗感染效果,與攻擊對照組相比,存活率分別提高了36.7%、66.6%、40%。斑馬魚感染豬鏈球菌后通過注射LySMP可顯著

11、提高存活率的事實提示,LySMP可作為防控豬鏈球菌病的一種高效抗感染制劑。豬鏈球菌烈性噬菌體SMP宿主譜很窄,僅可感染豬鏈球菌SS2-H和SS2-6形成噬斑,因而制約了噬菌體在防控豬鏈球菌上的應(yīng)用。為了闡明噬菌體與豬鏈球菌相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ),本研究通過化學(xué)和酶法以及原生質(zhì)體吸附等方法確定了噬菌體在豬鏈球菌上的受體成分。通過提取細菌細胞壁,將細胞壁稀釋后用蛋白酶K、SDS、變?nèi)芫靥幚淼姆椒?分別破壞蛋白或多糖成分,再與噬菌體共孵育,發(fā)現(xiàn)

12、采用變?nèi)芫靥幚淼募毎诳墒故删w的吸附率降低至23.1%;制備SS2-H原生質(zhì)體,作原生質(zhì)球吸附試驗,結(jié)果顯示噬菌體對原生質(zhì)體吸附率為0。分別用甘露糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖等組成噬菌體磷壁酸的成分進行結(jié)合阻斷試驗,結(jié)果表明,甘露糖、鼠李糖、氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖對SMP分別有32.3%、41.9%、50%和25.8%的阻斷作用。在可逆性吸附試驗中,分別在30min、60min和90min