豬鏈球菌噬菌體SMP的抑菌作用及其增殖動力學研究.pdf

1、豬鏈球菌病一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病,特別是隨著抗生素的濫用,豬鏈球菌對抗生素呈現嚴重耐藥和多重耐藥,給該病的防控帶來新的困難。開發(fā)新型抗菌制劑顯得非常重要,而噬菌體作為抗菌制劑頗具應用潛力。本文通過對豬鏈球菌2型及其烈性噬菌體SMP全長基因序列的分析,建立了能同時檢測噬菌體和豬鏈球菌的通用PCR方法;并建立了能分別檢測豬鏈球菌2型或其噬菌體的快速熒光定量PCR方法;應用豬鏈球菌攻擊CD1小鼠后,用豬鏈球菌烈性噬菌體SMP進行治療,結果

2、顯示該噬菌體具有治療豬鏈球菌感染的可行性;初步探索了噬菌體與豬鏈球菌互作的動力學關系,為進一步應用噬菌體進行豬鏈球菌病治療奠定了基礎。實驗發(fā)現對豬鏈球菌噬菌體的分離存在很大難度,應用雙層瓊脂培養(yǎng)法挑取噬菌斑的傳統(tǒng)分離方法具有諸多局限性,為了解決這一問題,以健康巴馬香豬鼻拭子樣本中分離出的一株SS2的烈性噬菌體SMP為模板,建立了豬鏈球菌2型及其噬菌體的通用PCR檢測技術,該方法可以同時檢測細菌和噬菌體的存在與否。通過比較噬菌體SMP和其

3、他99株鏈球菌或噬菌體的基因組發(fā)現,SMP雖然保守區(qū)段很多,但卻很短,其中主要有int、lysin等基因,而single strand binding gene在blast結果中顯得最保守。針對single-stand binding gene序列設計引物,建立了PCR檢測方法,可在豬鏈球菌和噬菌體SMP的目標區(qū)段檢測到條帶,回收測序證明是目標條帶,而在對照組大腸桿菌及其噬菌體中未發(fā)現條帶。通過優(yōu)化PCR反應條件,檢測下限可達103cf

4、u/mL。應用該方法可以同時篩選到噬菌體和相關宿主菌,可提高噬菌體的分離概率。進一步通過200nm濾膜過濾,可實現噬菌體和細菌的分離,并可通過下述的噬菌體快速熒光定量PCR檢測技術確認噬菌體的存在。通用檢測可實現對豬鏈球菌2型烈性噬菌體有無的快速初步鑒定,甚至溶源階段的噬菌體也可以檢測。利用該方法,可加快噬菌體的分離工作,比傳統(tǒng)的“盲傳”分離更加高效。另外,通用檢測方法可以應用到前噬菌體分析中,這是首次提出用PCR進行豬鏈球菌前噬菌體檢

5、測。為了評估烈性噬菌體在動物實驗中對豬鏈球菌2型的抑菌作用、研究噬菌體和豬鏈球菌2型互作后各自的消長情況,以評價烈性噬菌體對感染豬鏈球菌動物的保護力,針對豬鏈球菌2型及其噬菌體SMP分別建立了快速熒光定量PCR檢測技術。本文使用豬鏈球菌溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein, MRP)毒力基因mrp作為豬鏈球菌檢測的目標基因。結果顯示,豬鏈球菌快速熒光PCR檢測技術可以在30分鐘內把豬鏈球菌2型鑒定出來并

6、實現定量,定量的下限低于30個模板每毫升，特異性實驗顯示它可以很好地排除大腸桿菌及其噬菌體、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和其自身噬菌體SMP等的干擾。在噬菌體SMP快速熒光定量PCR檢測中,選用lysin作為目標基因,同樣噬菌體SMP快速熒光PCR檢測可在30分鐘內鑒定出SMP并實現定量,定量下限低于30個模板每毫升，特異性實驗顯示它可以很好地排除大腸桿菌及其噬菌體、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌等的干擾。結合噬菌體SMP快速熒光定量P

7、CR檢測和豬鏈球菌與噬菌體通用檢測,把豬鏈球菌與噬菌體通用檢測作為一級檢測、噬菌體SMP快速熒光定量PCR檢測作為二級檢測,可以很方便地檢測到豬鏈球菌噬菌體,為噬菌體分離提供便利。通過計算噬菌斑、平板裂解、細菌與噬菌體共培養(yǎng)后的濁度測定可定性了解噬菌體SMP的殺菌能力。為了進一步定量分析細菌與噬菌體的互作動力學特征,本文進行了細菌與噬菌體共培養(yǎng)的定量實驗。將豬鏈球菌2型與噬菌體SMP共同培養(yǎng),每隔一定時間取樣,使用熒光定量PCR測算細菌

8、與噬菌體的數量。為了更好地研究噬菌體與其宿主菌的動態(tài)關系,定量實驗中建立了捕食者數學模型,并根據定量實驗的數據,擬合出結果。定性實驗和定量試驗都顯示噬菌體SMP具有良好的殺菌和抑菌能力,這為SMP的治療性應用提供了可能。數學模型擬合結果顯示SMP與其宿主菌可以適用捕食者模型,首次提出用生態(tài)數學模型來模擬微生物之間的關系,為噬菌體與其宿主菌的互作關系研究提出一條可行性路線,為應用噬菌體治療提供了理論基礎。為了研究噬菌體SMP對豬鏈球菌感染

9、的治療作用,確認SMP對感染豬鏈球菌2型的動物具有保護力,進行了小鼠攻擊保護試驗。以CD1小鼠作為模式動物,在用豬鏈球菌攻擊后,采用靜脈注射SMP進行噬菌體體內抗菌活性研究。通過統(tǒng)計噬菌體處理組和細菌攻擊對照組小鼠體內的細菌增殖情況,揭示了噬菌體對活體動物具有殺菌效果。試驗研究了噬菌體SMP對豬鏈球菌SS2-4的抗感染效果。將小鼠分為4組,分別是PBS陰性對照、噬菌體對照、細菌攻擊對照、細菌攻擊后噬菌體處理。采用尾靜脈注射,每隔一定時間