豬鏈球菌噬菌體穿孔素(holin)基因的定位、功能確認(rèn)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）2型因致多起人嚴(yán)重感染和死亡事件而引發(fā)關(guān)注，臨床分離菌株大多呈現(xiàn)對(duì)抗生素嚴(yán)重耐藥和多重耐藥，抗生素應(yīng)用面臨挑戰(zhàn)，而基于噬菌體的抗菌策略則再現(xiàn)潛力。目前，國內(nèi)外對(duì)豬鏈球菌噬菌體裂解的生物化學(xué)基礎(chǔ)和裂解機(jī)制鮮有研究，故本論文預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了穿孔素基因（HolSMP）的存在，分析了基因序列或功能域與其生物學(xué)功能的相關(guān)性，確認(rèn)了噬菌體SMP存在“穿孔素-裂解酶”裂菌系統(tǒng)，揭示了穿孔素的胞外裂菌作用，為

2、應(yīng)用噬菌體裂解系統(tǒng)防控豬鏈球菌感染奠定了理論基礎(chǔ)。
　　為了挖掘豬鏈球菌噬菌體基因組上的穿孔素基因，基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析發(fā)現(xiàn)，穿孔素基因（HolSMP）定位于裂解酶基因（LySMP）上游，位于基因組7267~7695位堿基，全長(zhǎng)429bp，與鏈球菌（尤其是肺炎鏈球菌）噬菌體的穿孔素蛋白序列具有同源性。鑒于穿孔素基因序列的特殊性和編碼產(chǎn)物的復(fù)雜性，將基因HolSMP可能編碼的所有蛋白統(tǒng)稱為HolSMP；而該基因全長(zhǎng)編碼的分子量約

3、15.7 kDa的膜蛋白命名為HolSMP(142)。HolSMP(142)包含穿孔素第四超家族保守序列，具有Ⅰ型穿孔素蛋白結(jié)構(gòu)特征。
　　為了分析HolSMP在噬菌體感染宿主菌后的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)特征，本論文在優(yōu)化噬菌體懸液制備和豬鏈球菌細(xì)胞膜提取方案的基礎(chǔ)上，基于噬菌體SMP的一步生長(zhǎng)曲線，提取噬菌體SMP感染后不同時(shí)間點(diǎn)的豬鏈球菌2型菌株SS2-H的總RNA和膜蛋白，通過反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在噬菌體感染20 mi

4、n時(shí)，HolSMP基因開始轉(zhuǎn)錄，60 min時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值。用蛋白質(zhì)免疫雜交分析HolSMP的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在感染20 min后可檢測(cè)到HolSMP蛋白，60 min時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值。結(jié)果表明，在SMP感染宿主菌后HolSMP基因被轉(zhuǎn)錄，其編碼的蛋白HolSMP分布于細(xì)胞膜上，提示基因HolSMP具有穿孔素基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和亞細(xì)胞定位特征。
　　為了揭示HolSMP基因的功能，選擇合適的評(píng)價(jià)系統(tǒng)非常關(guān)鍵。鑒于穿孔素蛋白發(fā)揮

5、功能無種屬特異性，故大腸桿菌也可作為研究革蘭氏陽性菌噬菌體穿孔素蛋白功能的理想系統(tǒng)。本論文構(gòu)建了攜帶HolMSP基因的重組質(zhì)粒pEXH1，并在大腸桿菌的背景下證實(shí)HoLSMP是SMP的穿孔素基因：HolSMP基因的表達(dá)抑制了重組菌BL21(DE3)的生長(zhǎng)、導(dǎo)致了BL21(DE3)pLysS的快速裂解；HolSMP基因的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)菌的細(xì)胞膜上；能量毒素氰化鉀可以提前觸發(fā)HolSMP基因表達(dá)產(chǎn)物形成跨膜通道并引起菌體裂解，符合穿孔素判

6、定的重要標(biāo)準(zhǔn)；HolSMP基因和LySMP基因的共表達(dá)可以迅速觸發(fā)細(xì)菌裂解，說明二者可能在噬菌體SMP釋放過程中發(fā)揮協(xié)同胞內(nèi)裂菌作用；HolSMP基因可以補(bǔ)償穿孔素基因缺失型λ噬菌體的相應(yīng)功能，并使之形成噬菌斑。這些結(jié)果表明HolSMP基因具有編碼穿孔素的功能。
　　為了解析穿孔素基因HolSMP的結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性，通過對(duì)該基因的分析發(fā)現(xiàn)，其編碼的全長(zhǎng)蛋白HolSMP(142)含有10個(gè)由“ATG”編碼的甲硫氨酸，分別以這10個(gè)

7、“ATG”為起始密碼子，擴(kuò)增穿孔素HolSMP基因片段，其表達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的胞內(nèi)裂菌表型。以前5個(gè)“ATG”為起始密碼子的HolSMP基因片段的表達(dá)均導(dǎo)致宿主菌裂解，其中以第五個(gè)“AT G”為起始密碼子，其裂菌時(shí)間點(diǎn)較表達(dá)HolSMP基因全長(zhǎng)提前20 min，而該密碼子發(fā)生突變后HolSMPa43c基因可導(dǎo)致裂菌時(shí)間延遲15 min。據(jù)此，初步推測(cè)穿孔素基因HolSMP可能具有與λ噬菌體穿孔素基因S相似的“雙起始”基序。另外，以第6個(gè)“

8、AT G”為起始密碼子的HolSMP(103)對(duì)宿主菌無毒性，適用于制備HolSMP抗體。研究表明穿孔素的生物學(xué)活性與其功能域密切相關(guān)，通過缺失突變發(fā)現(xiàn)，缺失任一跨膜區(qū)均會(huì)導(dǎo)致穿孔素的生物學(xué)活性降低甚至喪失。同時(shí)，研究顯示HolSMP基因兩端分別或同時(shí)添加組氨酸標(biāo)簽編碼序列，均會(huì)引起穿孔素介導(dǎo)的宿主菌裂解時(shí)間的改變和裂菌強(qiáng)度的下降。
　　為了大量獲得保持生物學(xué)活性的豬鏈球菌噬菌體穿孔素，本論文對(duì)穿孔素基因的表達(dá)策略進(jìn)行了優(yōu)化。比較

9、了大腸桿菌、乳酸乳球菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母等表達(dá)系統(tǒng)對(duì)HolSMP基因的表達(dá)效果，最終確定大腸桿菌BL21(DE3)pLysS是目前最理想的穿孔素表達(dá)系統(tǒng)，建立的濃縮對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液再進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)工藝凸顯優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)在保持穿孔素生物學(xué)活性的前提下，HolSMP(142)的Gly139殘基是可以插入組氨酸標(biāo)簽的唯一位點(diǎn)。基于該標(biāo)簽，表達(dá)純化HolSMP蛋白，測(cè)定其胞外裂菌特性，結(jié)果顯示，該蛋白在37℃、pH5.2和添加0.8％β

10、-巰基乙醇的條件下裂菌活性最高。平板裂解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該蛋白可裂解金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌；與LySMP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能裂解分別對(duì)HolSMP和LySMP不敏感的7株豬鏈球菌2型菌株和1株沙門氏菌，表明噬菌體SMP的穿孔素能增強(qiáng)裂解酶的裂菌活性，具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。
　　綜上所述，位于裂解酶LySMP基因上游的穿孔素基因HolSMP所編碼的穿孔素蛋白與同源裂解酶可協(xié)同發(fā)揮裂菌作用，構(gòu)成豬鏈球菌噬菌體SMP的“穿孔素-裂解酶”