豬鏈球菌噬菌體SMP末端酶大亞單位的生物學活性研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis, S. Suis)是常見的人畜共患病病原菌,其中豬鏈球菌2型是流行范圍最廣、致病力最強、危害最嚴重的豬鏈球菌,能導致豬腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和人的腦膜炎,甚至會致人死亡,嚴重威脅著公共衛(wèi)生安全。預防、治療豬鏈球菌病一般采用抗生素,但隨著抗生素的濫用,菌株的耐藥性不斷增強,給該病的防控帶來了困難,基于噬菌體的治療策略再次成為研究熱點。末端酶(Terminase)是dsDNA病

2、毒包裝過程中的必要功能蛋白,其大亞單位在包裝過程中往往行使全酶的作用,一般具有 ATP酶活性和限制性內(nèi)切酶活性。豬鏈球菌噬菌體SMP是一株豬鏈球菌2型的烈性噬菌體,但目前對該噬菌體的末端酶的編碼基因和功能尚不清楚,本研究將通過大腸桿菌系統(tǒng)重組表達豬鏈球菌噬菌體末端酶大亞單位(TlsSMP),并研究TlsSMP融合蛋白的生物學活性。
　　本文利用SWISS-MODEL、NCBI CDD和PSIPRED等蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件預測了噬菌體(

3、SMP)末端酶大亞單位,結(jié)果顯示,末端酶大亞單位具有一個結(jié)構(gòu)域?；诘鞍兹壗Y(jié)構(gòu)的預測發(fā)現(xiàn),末端酶大亞單位與G2P(噬菌體SPP1核酸酶功能域)同源性最高,達到30.5％,重疊區(qū)域位于240aa-412aa處,預測的末端酶大亞單位具有末端酶的結(jié)構(gòu)特征。為了制備末端酶大亞單位,本文應用大腸桿菌重組表達系統(tǒng)獲得了具有生物學活性的TlsSMP。以噬菌體SMP基因組為模板,采用PCR方法擴增SMP末端酶大亞單位基因(TlsSMP),構(gòu)建pEas

4、y-E1-Tls重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。通過IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)于16℃誘導表達15 h,表達產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE分析,確定其為53.26 kD大小的TlsSMP融合蛋白。Western-blotting實驗進一步表明, TlsSMP融合蛋白可被特異性血清識別,呈可溶性表達。為了揭示重組TlsSMP的生物學功能,應用His-trap純化柱純化了融合蛋白,經(jīng)濃縮后,濃度可達1-1.5 mmol/L?；诹姿釞z測

5、試劑盒測定了TlsSMP融合蛋白水解ATP產(chǎn)生無機磷酸的水平,確認其具有ATP酶活性,進一步分析發(fā)現(xiàn),TlsSMP在pH7、23℃和Mg2+存在的條件下,其ATP酶活性最強,其它金屬離子如Ca2+、Mn2+和Co2+都對其有不同程度的抑制作用。除了ATP酶活作用外,末端酶大亞單位是否還具有限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶的作用,尚待進一步驗證。鑒于噬菌體末端酶在噬菌體等病毒包裝中的重要作用,通過深入研究可為研制安全、高效的抗病毒藥物、控制ds