轉(zhuǎn)化缺失的無莢膜肺炎鏈球菌作為活疫苗候選菌株的安全性及保護效果評價研究.pdf

1、目的：
　　 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是一種定植于人體上呼吸道的主要病原體，能夠引起危及生命的肺炎、敗血癥、腦膜炎以及像鼻竇炎、中耳炎等常見性疾病。鑒于目前肺炎鏈球菌耐藥菌株的大量增加，研制安全性高、保護效果好的疫苗是遏制肺炎鏈球菌感染的迫切需要。
　　 肺炎鏈球菌多糖疫苗(PPV)及結(jié)合疫苗(PCV)存在生產(chǎn)成本高、菌株類型覆蓋有限、血清型置換等弊端，于是本研究著眼于血清

2、型非依賴的減毒活菌疫苗的研發(fā)。本課題通過缺失肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因comE獲得轉(zhuǎn)化缺陷株，這類菌株失去獲得外源基因的能力，因此不易發(fā)生毒力回復(fù)。在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)化缺陷的無莢膜菌株，對其進行安全性、保護效果方面的研究，評價其作為減毒活疫苗的可行性。
　　 方法：
　　 通過基因替代失活的方式獲得缺陷菌D39△cps、R6△comE、D39△cps△comE并進行基因測序及計算體外轉(zhuǎn)化率來鑒定。安全性通過以下方面評價:

3、不同劑量攻毒小鼠進行生存率實驗;攻毒后采集并培養(yǎng)小鼠心臟血、鼻腔灌洗液、肺勻漿及腦勻漿觀察細菌定植情況;感染肺炎鏈球菌小鼠的肺部組織形態(tài)學(xué)觀察。保護效果通過以下方面評價:活菌疫苗鼻腔免疫小鼠后，D39強毒株攻毒觀察小鼠生存率;19F感染后觀察小鼠鼻咽部及肺部細菌載量;通過ELISA法檢測血清特異性抗體IgG及其亞型效價、細胞因子IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ水平。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建了缺陷菌R6

4、△comE、D39△cps△comE，外源基因整合率實驗中轉(zhuǎn)化缺陷菌R6△comE、D39△cps△comE轉(zhuǎn)化率均為零，而R6、D39△cps轉(zhuǎn)化率在1.4％～2.4％之間。
　　 鼻腔感染野生D39的小鼠組，平均生存時間為1.5天;而感染D39△cps、D39△cps△comE、R6、R6△comE的小鼠，均可完全存活，生存率為100％,且在血和腦中未檢測到細菌，其鼻腔灌洗液和肺部定植量均顯著低于陽性對照D39組。此外，在小

5、鼠的血液和腦勻漿中均無定植，表明這4株菌不侵入血液，不入腦。通過鼻腔感染后不同時間點肺部組織切片的觀察，發(fā)現(xiàn)comE缺陷菌株的肺部炎癥要輕于對應(yīng)野生菌，并且72h后感染這4株菌的小鼠肺部炎癥均基本恢復(fù)。
　　 粘膜免疫小鼠后，四組實驗組均可產(chǎn)生高效價的血清IgG（IgG1、IgG2b為主）;與佐劑對照組相比，細菌刺激免疫組小鼠脾細胞均可產(chǎn)生較高水平的特異性IL-4、IL-10以及IL-17;四組疫苗均可顯著降低19F在鼻咽部及肺

6、部定植;R6、R6△comE、D39△cps、D39△cps△comE四組疫苗對致死性D39感染的保護效果分別為60％、70％、70％、50％。
　　 結(jié)論：
　　 無莢膜的R6、D39△cps以及轉(zhuǎn)化缺陷株R6△comE、D39△cps△comE不會使BALB/c小鼠致病。轉(zhuǎn)化缺陷菌株與野生菌株粘膜免疫均能夠有效刺激機體的體液和細胞免疫反應(yīng)，有效抵D39強毒株的侵襲性感染和定植，保護效果之間無顯著性的差異。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)